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背景乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一,其中雌激素受体阳性者占60%-70%。雌激素受体阳性乳腺癌治疗的经典药物是他莫昔芬,但是他莫昔芬的长期使用会诱导乳腺癌的耐药。之前的大量研究已经证明雌激素受体本身的翻译后修饰与他莫昔芬耐药有显著的相关性。SMURF1在肿瘤细胞的细胞周期、增殖、分化、代谢、基因组稳定性、老化等方面具有重要作用。但SMURF1对于ERα通路的作用机制尚不明确。我们的初步研究结果显示SMURF1参与调节ERα信号通路。本课题通过使用实时定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀和泛素化相关免疫共沉淀方法,旨在研究SMURF1对ERα蛋白的翻译后调节以及ERα通路活性调节的分子机制,为乳腺癌的治疗以及逆转内分泌治疗耐药提供新的思路。目的通过分子生物学研究,有望探讨SMURF1蛋白对雌激素信号通路的调节机制及对他莫昔芬治疗的影响,为临床上逆转乳腺癌内分泌治疗的耐药揭示新的机制和药物靶点。方法1、查询TCGA、Kmplot、Oncomine数据库,探究SMURF1在人乳腺癌患者组织中的表达情况。2、在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系,运用全基因组RNA测序明确SMURF1是否影响ERα信号通路。3、在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系,运用细胞增殖实验明确SMURF1对乳腺癌细胞系增殖能力的影响,用qRT-PCR验证SMURF1的沉默效果,并用Western Blot验证沉默SMURF1后,ERα蛋白的表达情况。4、在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系,在加入或不加入雌二醇E2药物的情况下做对比,然后继续用qRT-PCR明确SMURF1对ERα靶基因的影响,最后用Luciferase荧光素酶报告基因技术验证SMURF1对于ERα转录活性的影响。5、阐明SMURF1对ERα蛋白的调节机制,用外源和内源性Co-IP实验探究SMURF1和ERα是否相互结合,并且分别构建SMURF1和ERα的不同结构的质粒,进一步探究SMURF1和ERα的具体结合部位。6、MG132实验、CHX实验、Co-IP及Western Blot等实验明确SMURF1对ERα蛋白的稳定性及稳定方式。7、小鼠移植瘤的体内实验去验证SMURF1对小鼠成瘤能力的影响。结果1、通过查询TCGA、Kmplot、Oncomine数据库,我们发现SMURF1蛋白在乳腺癌患者组织中比正常乳腺组织高,且SMURF1与乳腺癌患者不良预后有一定相关性,并且乳腺癌病人乳腺组织中SMURF1的表达量越高,病人的预后越差。2、运用RNA Sequence转录组测序发现,沉默SMURF1后可以明显抑制ERα下游靶基因的表达量。3、在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系,运用细胞增殖实验明确了si SMURF1后抑制了乳腺癌细胞的增殖能力,用qRT-PCR和Western Blot验证SMURF1的沉默效率,基本可以达到应用siRNA后,SMURF1的蛋白和mRNA水平只占原来的20%左右,并用Western Blot验证沉默SMURF1后,ERα蛋白的表达量下降。4、在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系,在加入或不加入雌二醇E2药物的情况下做对比,然后继续用qRT-PCR,Western Blot,Luciferase荧光素酶报告基因进一步证明了siSMURF1明显抑制ERα靶基因的表达。5、用外源和内源性Co-IP和GST-pull down实验说明了SMURF1和ERα是相互结合的,且是间接的相互结合。并且核浆分离结果显示SMURF1主要位于浆内,且SMURF1和ERα的结合也发生在浆里,分别构建SMURF1和ERα的不同结构的质粒,进而继续做Co-IP,结果显示SMURF1通过HECT段和ERα的AF1段相互结合。6、在HEK293T细胞内做MG132(蛋白酶体抑制剂)实验、CHX(蛋白合成抑制剂)等实验证明了SMURF1可以延长ERα的半衰期。进一步用K48、K63质粒证明了SMURF1是抑制ERα的K48形式的多聚泛素化,从而发挥稳定ERα作用。7、在裸鼠的乳房脂肪垫里原位种植稳转shSMURF1的MCF-7细胞株,4周后发现shSMURF1的小鼠移植瘤生长明显减慢,且体积小、重量轻。结论在ERα阳性乳腺癌细胞系中SMURF1的HECT段与ERα的AF1段结合,进而抑制ERα的K48的多聚泛素化,从而稳定ERα。