微小隐孢子虫转运蛋白免疫原性及微小隐孢子虫和鸵鸟源小鼠隐孢子虫寄生部位初步研究

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ontheroad2005
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隐孢子虫是一种全球范围内的人兽共患寄生性原虫,可导致免疫抑制群体致死性腹泻,具有重要的公共卫生意义,目前尚未发现可以防治的特效药。ABC转运蛋白是一类跨膜蛋白家族,此家族成员可以利用ATP水解产生的能量将其结合的底物跨膜转运。ABC蛋白广泛存在于各种生物体内,和营养转运,药物、内外毒素的吸收排泄有关。因此,我们有必要对隐孢子虫转运蛋白进行初步研究,研究其作为药靶的潜在可能性。本研究通过推测的10个微小隐孢子虫转运蛋白等膜蛋白部分序列,在NCBI数据库中Blast得到对应基因片段及基因描述,通过Clustal X1.83把推测出来的小肽和由基因片段翻译出来的完整蛋白质序列进行序列比对,确定了这些小肽在完整蛋白质上的位点。使用各个完整的蛋白质序列Blast并未搜索到同源序列,因此也证明了这些小肽具有特异性。委托合成的9条多肽做了纯度鉴定和组分鉴定。并将9个合成多肽中的6个和载体蛋白BSA偶联制备了全抗原,并用SDS-PAGE做鉴定确定偶联成功;以EC-BSA等完全抗原为免疫原,选择2Kg体重的日本大耳白兔6只进行免疫。首先,EC-BSA PBS等完全抗原溶液与等体积的FCA混合成乳剂,背部皮下多点注射,剂量是每只1 mg完全抗原;每隔14日以同剂量完全抗原溶液与等体积的FIA混成乳剂免疫。共免疫6次,第6次加强免疫剂量是2mg/只。第三次免疫后每隔2周测一次血清效价。ELISA检测条件为抗原1:100稀释,包被后4℃过夜,1%BSA-PBST为包被液,血清1:100及倍比稀释,最终平行测定以血清1:1000做平行比较,P/N≥2为阳性,结果均为阳性。效价分别是兔1 (LC) 0.573、兔2 (IC) 2.047、兔3 (KC) 1.727、兔4 (KC-P436) 1.993、兔5 (RC ) 1.985、兔6 (LC-1) 1.497。使用H.E、PAS、甲苯胺兰几种染色的方法染色病理组织观察虫体、宿主感染组织以及炎性细胞。利用实验室保存C. parvum卵囊和C. muris卵囊感染沙鼠进行了初步的病理组织学和超微结构的研究,确定C. parvum主要寄生在沙鼠十二指肠、空肠、回肠,引起肠道微绒毛变短脱落。C. muris在沙鼠主要寄生部位是贲门、幽门和胃底。本试验利用推测并合成的微小隐孢子虫转运蛋白及相关蛋白等部分序列制备出兔多抗血清,为进一步研究微小隐孢子虫转运蛋白等膜蛋白在虫体及宿主之间的定位打下基础。也为研究隐孢子虫的代谢研究做出铺垫。
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