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小麦条锈病是由活体专性寄生真菌--条形柄锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引起的一种严重危害小麦生产的流行性真菌病害。从分子水平了解小麦--条锈菌互作机制对防治小麦条锈病具有重要意义。植物类受体激酶（Receptor-like kinases,RLKs）接受外界信号并传递到胞内,引起植物的防御反应,在先天免疫中具有重要作用。由非亲和病原菌侵染植物形成的过敏性坏死反应（Hypersensitive reaction,HR）是最常见的一种植物抗病形式。很多研究表明具有caspase活性的液泡加工酶（vacuolar processing enzyme,VPE）参与了液泡蛋白的成熟以及激发子诱导的HR和气孔关闭。因此展开对小麦类受体激酶和坏死相关基因的功能研究,对于丰富了解植物体内信号传递途径,揭示小麦抗条锈病分子机理具有重要意义。本论文筛选、分离了 2个小麦类受体激酶和3个VPE基因,研究其在小麦与条锈菌互作过程中的功能。主要完成以下成果:1.类受体激酶基因克隆及功能分析通过搜索小麦与条锈菌互作cDNA文库,经过序列比对、拼接和PCR扩增获得两条受条锈菌CYR23上调诱导表达的类受体激酶序列,分别命名为:TaLRR-RLK和TaBRI1。编码的蛋白定位于细胞质膜,结构上具有N端信号肽、富含LRR的胞外域、跨膜结构域和胞内域。表达特征分析发现:TaLRR-RLK受机械伤害、低温、干旱、茉莉酸甲酯和水杨酸不同程度上调诱导表达,TaBRI1受机械伤害、干旱、水杨酸、乙烯和脱落酸不同程度诱导表达。TaLRR-RLK和TaBRI1在小麦与条锈菌非亲和互作过程早期有不同程度的诱导上调表达,而在亲和反应中表达量无明显变化。通过BSMV-VIGS瞬时沉默TaLRR-RLK和TaBRI1,在接种CYR23的小麦叶片上观察到明显的过敏性坏死,同时在坏死点附近产生少量的夏孢子堆。组织学观察发现在沉默植株中,菌丝长度较对照明显增长,单个侵染点附近菌落面积增加,而每个侵染点H202积累面积和过敏性坏死面积比对照明显减少。防卫相关基因表达量在沉默植株中被不同程度抑制,而清除活性氧相关基因被急剧大量诱导上调表达。这些结果表明TaLRR-RLK和TaBRI1的沉默减弱了小麦对条锈菌CYR23的抗性。因此TaLRR-RLK和TaBRI1在小麦对条锈菌侵染防御过程中起正向调控作用。利用原核表达系统摸索TaLRR-RLK可溶性蛋白表达条件;利用DUALmembrane系统筛选到TaLRR-RLK的两个候选互作蛋白,N11编码一个核酮糖二磷酸羧化酶/氧合酶小亚基,N47编码一个受胁迫诱导的短肽。利用基因枪转化法获得TaBRI1突变体植株,观察突变体与野生型对小麦条锈菌的抗性差异。2.坏死相关基因VPE克隆及功能分析获得三个新的小麦VPE基因,通过序列比对、进化树分析,分别命名为TaVPE1a、TaVPE3和TaVPE4。三个基因编码的蛋白均存在信号肽序列,未成熟的TaVPEs氮端区域相似性较低,而成熟蛋白的氮端区域则高度保守。进化树分析表明VPE家族成员与大麦亲缘关系较近,TaVPE1a为种子型VPE,TaVPE3和TaVPE4为营养型VPE。表达谱分析发现:Ta VPE1a被低温、干旱、乙烯、脱落酸和茉莉酸甲酯诱导表达;TaVPE3被机械伤害、干旱、水杨酸、乙烯和脱落酸显著诱导表达;TaVPE4被机械伤害、低温、干旱、水杨酸、乙烯和脱落酸不同程度诱导表达。TaVPE1a、Ta VPE3和Ta VPE4在小麦与条锈菌非亲和互作中有不同程度上调诱导表达,推测TaVPE3和Ta VPE4主要参与了小麦与条锈菌互作过程中的防卫反应。瞬时沉默Ta VPEs,通过对沉默植株接种条锈菌叶片表型观察,防御相关基因和清除活性氧相关基因表达量测定及组织学观察发现:TaVPE1基因的沉默与小麦植株对条锈菌的抗性无明显影响;TaVPE1a的沉默在一定程度上减弱了小麦对条锈菌的抗病性,却不足以改变由小麦条锈菌诱发的表型变化。TaVPE3和Ta VPE4的沉默降低了小麦对条锈菌的抗性,改变了条锈菌的生长情况,导致了条锈菌非亲和小种侵染诱发的表型变化。TaVPEs在小麦、烟草叶片和酵母瞬时过表达实验表明,VPE家族三个成员本身不能诱发或抑制细胞坏死,但可增强不同胁迫诱发的细胞坏死,因此它们对条锈菌无毒性小种侵染小麦过程中引起的PCD可能有不同程度的贡献。通过筛选酵母双杂交cDNA文库,获得了在小麦体内与不同VPE存在直接相互作用的蛋白。