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海参溶菌酶具有较高的抑菌活性,其抑菌作用主要是通过水解细胞壁肽聚糖上的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键,破坏菌体的保护层。研究发现,海参溶菌酶具有较强的热稳定性,且热处理后,蛋白的抑菌活性明显提高,但其分子机制尚不明确。为了深入研究温度对海参(Stichopusjaponicus)溶菌酶蛋白(SjLys)抑菌性质的影响,实验选取海参溶菌酶蛋白上具有抑菌活性的C端片段区域(SjLys-C)进行分析。首先,本实验成功构建了重组表达质粒pET-30a(+)-SjLys-C并在,E.coli Rosetta(DE3)pLysS得到表达。此外,本实验还优化了已构建的pET-32(+)-SjLys-C表达系统,将重组质粒转入有助于蛋白二硫键正确折叠的新的表达宿主E.coli Rosetta-GamiB(DE3)pLysS中,在体外获得高效表达的海参溶菌酶C端多肽。在新的表达宿主中,经IPTG诱导,表达的重组蛋白绝大多数以可溶的形式存在,且重组蛋白具有抑菌活性。实验利用Ni2+亲和层析偶联G-25葡聚糖凝胶层析分离、纯化目的蛋白,最终目的蛋白的纯度可以达到92%以上。其次,研究还通过抑菌实验比较和分析热处理后重组SjLys-C蛋白对指示菌株抑菌活性的变化。抑菌实验结果表明,重组SjLys-C蛋白对四种指示菌株都具有明显的抑菌作用;并且经热处理后,重组SjLys-C蛋白的抑菌活性明显提高。最后,为深入了解热处理后海参溶菌酶抑菌活性增强的分子机制,本文首次通过分子动力学模拟(MD)方法对热处理后SjLys-C的分子构象进行检测分析。在30℃和100℃条件下,分析了根均方偏离(RMSD)、根均方涨落(RMSF)、回旋半径(Rg)和蛋白三级结构的变化。通过分子动力学模拟结果可以发现,30℃和100℃条件下的RMSD值变化微小,有四个区域的RMSF值出现波动,100℃的Rg值略小于30℃时的值;从模拟的三级结构可以看出,经高温处理后蛋白的整体三级结构并没有发生大的变化,只有蛋白序列N端附近一小部分区域发生了结构的调整。同时研究还发现,该蛋白在100℃时,两个活性位点的距离小于30℃时对应的两个活性位点的值。通过低温退火模拟,发现退火后的蛋白结构基本保持稳定,只有在N端附近的一小段区域的结构发生了微小变化。分子动力学模拟结果可为进一步研究海参溶菌酶的活性提供理论依据,为后续的氨基酸定点突变以提高酶活提供一个可靠的研究方法。