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研究目的1.筛选小细胞肺癌中干细胞与非干细胞差异表达的关键miRNAs。2.探讨关键miRNAs对H446细胞体外自我更新能力的影响。研究方法1.课题组前期工作证明小细胞肺癌细胞系H446肿瘤球中富集了干细胞样细胞。本实验通过无血清培养技术在小细胞肺癌细胞系H446、H209和H69中获得第四代肿瘤球细胞。2.利用microRNA芯片技术,检测小细胞肺癌细胞系中干细胞和非干细胞的microRNA表达谱,筛选出两群细胞中差异表达的miRNAs。3.利用miRBase数据库,分析差异表达miRNAs的种子序列。4.根据较大差异倍数及其他筛选策略进一步筛选miRNAs。5.应用qRT-PCR方法,在上述三个细胞系的干细胞和非干细胞中验证其表达,并选定三个细胞系中恒定差异表达的miRNAs作为关键miRNAs。6.利用转染技术,降低或升高关键miRNAs的表达水平后,进行肿瘤球形成、克隆形成和MTT实验,了解关键miRNA对H446细胞体外自我更新和增殖的影响；通过免疫荧光染色,检测uPAR和CK的表达,了解其对细胞分化的影响。7.利用miRNA靶基因预测软件,分析关键miRNA和一些种子序列相同的重要miRNAs可能调控的靶基因,筛选出调控细胞增殖、凋亡和细胞周期的靶基因。结果1.小细胞肺癌细胞系H446干细胞与非干细胞的miRNA表达谱microRNA芯片结果显示：第四代肿瘤球细胞和亲代细胞之间相比,有86个差异表达的miRNAs (P＜0.01),其中48个miRNAs表达上调,38个miRNAs表达下调。2.小细胞肺癌干细胞与非干细胞差异表达的关键miRNA(1)差异表达miRNAs的种子序列分析：鉴于miRNAs的种子序列直接介导miRNAs与其靶基因的相互作用,因此,我们进一步分析了上述86个差异表达miRNAs的种子序列,并将具有相同种子序列的miRNAs归为一组。结果显示：86个miRNAs中具有相同种子序列的miRNAs有29个,共组成9组。(2)进一步筛选miRNAs:86个差异表达的miRNAs中,根据上述筛选策略,筛选出6个miRNAs,其中let-7、miR-20、miR-21、miR-27a和miR-30b表达下调,miR-149*表达上调。(3)验证并最后选定关键miRNAs:qRT-PCR结果显示6个miRNAs在三个细胞系的肿瘤球细胞和亲代细胞之间的表达水平确有差异,证实了microRNA芯片结果；但是,仅miR-27a在三个细胞系的肿瘤球中恒定低表达,其余5个miRNAs在三个细胞系的肿瘤球中表达趋势不一致。3. miR-27a调控H446细胞体外自我更新(1) miR-27a下调增加肿瘤球形成和克隆形成：在亲代细胞H446中转染miR-27a抑制剂下调miR-27a的表达,体外无血清成球实验和克隆形成实验结果显示：转染miR-27a抑制剂的细胞形成更多的肿瘤球和细胞集落。就形态而言,转染miR-27a抑制剂组形成的肿瘤球更大。(2) miR-27a下调增强细胞增殖：转染miR-27a抑制剂和阴性对照后,通过MTT实验观察不同时间点的细胞活力,结果显示：转染miR-27a抑制剂的细胞在转染后48h和72h,细胞活力明显高于转染阴性对照的细胞。(3) miR-27a下调抑制细胞分化：将转染miR-27a抑制剂和阴性对照的细胞培养72h后进行免疫荧光染色,结果显示：转染miR-27a抑制剂显著增加了uPAR+细胞和CK-细胞的数目。4.靶基因预测通过miRNAs靶基因预测软件TargetScan5.1(http://www.targetscan.org/),筛选出了与细胞增殖、凋亡以及细胞周期相关的基因。如miR-27a调节的与细胞增殖、凋亡以及细胞周期相关的靶基因有BCLAF1、BAK1和CCNG1,miR-27b调控的与细胞增殖、凋亡以及细胞周期相关靶基因有BAK1和CCNG1。结论1.小细胞肺癌细胞系H446干细胞和非干细胞的miRNAs表达存在差异。2. miR-27a是小细胞肺癌干细胞的关键miRNA,低水平的miR-27a可能是小细胞肺癌干细胞的内在特征。3.miR-27a下调增加H446细胞体外自我更新能力,降低细胞分化。总之,miR-27a下调增加了H446细胞的干性,提示miR-27a可能在维持小细胞肺癌干细胞功能中发挥重要作用。