癌症高发与环境污染息息相关,联合国2017年发布的全球环境报告中,全世界癌症患者有超过20%的人是因为空气污染、水污染和接触有毒物质而罹患癌症;无论是发达国家还是发展中国家,癌症都已经成为严重威胁人类身体健康的重要疾病,我国自2000年以来,人群中癌症发病率一直呈上升趋势。基础研究为攻克癌症做出了巨大贡献。从希波克拉底命名癌症到TCGA计划宣布完成,已有2000多年,癌症的定义也从“螃蟹状”肿块变成一种复杂的多基因突变遗传病;随着越来越精细的技术出现,癌症研究已经跨入高通量和单细胞领域相结合的时代,随着癌症异质性、癌细胞亚群、癌症干细胞和癌细胞克隆性进化等前沿理论出现,让研究者既可以从癌症全部肿瘤细胞整体出发研究癌症的共性,也能将视野探入肿瘤微环境,研究不同肿瘤细胞亚群的基因选择性突变和肿瘤细胞与周围环境中其他细胞的相互作用。这种研究方法和技术的升级引领癌症基础研究进入成果大爆发时期,随之而来的成果转化让癌症诊疗方式和方法产生深刻变革;以高通量芯片/测序技术为主导的癌症个性化诊断方案正逐渐在临床应用,以癌症免疫疗法为主导的癌症个性化治疗手段正逐步惠及更多患者。借助生物信息学与高通量芯片/测序技术和多重组学相结合的方法,研究者已经绘制出了肿瘤细胞全基因组与全蛋白组互作调控谱,揭示了基因突变与癌症发生的关系;其中研究突变p53的调控与功能是这个研究领域最重要的组成部分。据世界卫生组织下属的国际癌症研究机构（IARC）和TCGA数据库的统计,超过50%的癌症发生与p53基因突变紧密相关;超过80%的癌症最终都会发生p53基因突变;这些数据深刻阐释了,即便在强调多基因协同研究的今天,细胞中发生p53基因突变依然是公认的最危险致癌因素。我们在早期实验中发现,三株不同来源小鼠端粒酶阴性瘤化细胞中共享一个p53突变——p53^N236S（人类中为N239S,p53S）,后续的研究表明p53S可以促进肿瘤细胞迁移、浸润和抗凋亡;最近来自Nature和Cell的两篇研究更是将p53S列为复发性突变,癌症中的复发性突变是决定癌细胞表型的重要突变,是一种克隆性驱动突变,并且携带这种低频热点突变的突变p53是重要的癌症临床表型的赋予者,例如通过特殊的细胞通路调控机制赋予肿瘤亚群显著的耐药能力。本研究正是基于p53S高通量芯片数据的深入挖掘与基因调控网络的结合,从基因组全局出发,深入解析p53S功能获得机制及其在促进肿瘤形成中的作用。我们首先对p53S转录谱进行分析,并创新的利用ss GSEA方法分析转录数据,将实验组与对照组的富集分数相减得出实验组的相对改变富集分数,再用对照组原富集分数的绝对值除以相对改变富集分数,通过将各个基因集富集分数进行巧妙转换,使结果中既包含实验组与对照组的上下调信息,也包含了实验组相对于对照组的变化程度信息,在此基础上,我们绘制了全面的p53S小鼠全基因组转录谱。在转录层面对p53S功能获得机制的初步研究中发现小鼠胚胎成纤维细胞中,p53S有77.8%的靶基因与野生型p53不同,利用Circos绘制的全基因组转录谱显示p53S与野生型p53一样具有转录调控基因的能力,其靶基因分布于各个染色体上,两个结果共同提示了p53S具有和野生型p53截然不同的基因调控机制;面对如此新颖的突变p53转录数据,我们利用PANTHER基因功能注释系统进行初步分析,发现p53S在生物进程基因术语下有更多的靶基因与转录调控及促转录调控能力相关,提示了p53S潜在的促转录调控能力,这种功能改变允许p53S更具“侵略性”的占据靶基因启动子进行转录调控;p53S在细胞组成基因术语下的富集则显著的提示了p53S具备调控细胞膜相关蛋白转录的能力,具备调控核仁和核质相关基因转录的能力,同时还具备调控线粒体功能的能力;在分子功能基因术语中,p53S则体现了与生物进程结果的一致性,两者都共同指向——p53S相比野生型p53具有更强转录、促转录和蛋白结合的能力。在综合利用Clue GO基因功能分析系统绘制的p53S功能注释分组网络中,我们发现,p53S影响的生物功能主要有系统发育、突触组装、骨骼骨化、器官形态、骨骼发育和肌肉结构发育等发育相关的功能,也有细胞迁移、细胞定位、白细胞增殖和间质细胞发育与分化等促进肿瘤形成相关的功能,并且这些分析结果与我们早期观察到的p53S小鼠表型十分吻合。之后,我们利用ss GSEA的富集结果结合R语言强大的数据可视化功能,成功绘制p53S转录调控谱,并发现p53S主要转录调控DNA损伤应答、免疫应答和雌激素应答的基因;于是,我们用DNA化学损伤剂——阿霉素处理p53S的MEFs,希望通过模拟化学性环境毒物对DNA的损伤从而激发p53S潜在的功能,在对比阿霉素未处理p53S MEFs的转录调控谱之后发现,在DNA损伤条件下,p53S表现出对DNA修复、凋亡、细胞周期G2/M期检验点和纺锤体检验点等野生型p53应答DNA损伤机制的功能丢失;与此同时,p53S显著调控了糖酵解、缺氧诱导、K-Ras信号上调、转化生长因子-β、p53通路以及活性氧等通路所涉及的基因启动子。通过该结果显著提示在化学性环境毒物模拟物阿霉素诱导的DNA损伤条件下,p53S失去应答DNA损伤信号功能的同时,能够选择性地转录调控与细胞生长、增殖以及癌细胞代谢相关的通路,提示了p53S具有癌基因潜能。接下来,我们深入分析高通量表达谱数据,鉴定出12组在不同细胞状态下p53S通过功能获得与功能丢失两种机制转换作用下的基因表达聚类。其中,p53S的功能丢失与功能获得转换体现在:无阿霉素处理与被阿霉素处理时,p53S会显著的改变对缺氧诱导和糖酵解通路的调控方式,从无处理组中的下调变成阿霉素处理组的上调。同时,这种功能转换还使PI3K通路基因集显著上调与富集,提示了在化学性环境毒物模拟物阿霉素诱导的DNA损伤条件下,p53S可能通过调控PI3K相关通路来施展其癌基因的能力;DNA修复通路基因集的上调,以及G2M检验点和有丝分裂纺锤体检验点等通路中也出现了相似的DNA损伤信号诱导的基因上调现象。同时,我们认为p53S应答DNA损伤信号时选择性下调p53通路的功能丢失现象反应了p53通路的调控状态在维持突变p53功能获得机制中具有重要作用。本研究还发现一种突变p53的新功能,我们将其命名为突变p53的功能改变与增强机制（Alteration and enhancement of function）,即通过改变和增强野生型p53原有调控通路基因的表达——上调原有被野生型p53抑制的基因,下调原有被野生型p53促进的基因。传统理论认为突变p53维持自身稳定性通过三种途径来完成:1.通过功能丢失机制失去激活MDM2表达的能力;2.基因突变导致蛋白构象变化而弱化同MDM2的结合能力;3.通过与HSP70/90等分子伴侣结合阻滞MDM2的结合。对p53S小鼠肿瘤组织与正常组织的高通量表达谱检测发现在p53S小鼠肿瘤中编码p19^ARF的基因CDKN2A的m RNA表达量是对照组的270倍,这与传统理论对p19^ARF是抑癌因子的认识相悖。因此,我们进行了组织、细胞水平的实验研究验证,发现了突变p53维持自身稳定的新机制,同时揭示了p53S诱导抑癌因子p19^ARF高表达促进癌症发生的机制。通过对p53S小鼠肿瘤原代细胞进行核型分析,发现其中存在大量双微体（DMs）,双微体是基因组不稳定的标志,也是癌症恶性程度的指征;对其γ-H2AX蛋白水平检测发现当p53S蛋白大量表达时,细胞内γ-H2AX表达剧增,显著提示p53S增强基因组不稳定性的同时释放DNA损伤信号,;稳定敲低p53S的蛋白表达引发p19^ARF蛋白表达量显著下调和MDM2蛋白表达上调,反过来,敲低p19^ARF也能导致p53S蛋白表达下调,充分证明了p53S与p19^ARF存在共同高表达机制;随后对小鼠肿瘤样本中p19^ARF编码基因CDKN2A进行测序发现没有发生任何突变,全部都是野生型CDKN2A。为了进一步证明该机制在人类癌症中也同样存在,我们考察了TCGA数据库中突变p53和野生型p53肉瘤患者CDKN2A的m RNA表达情况,发现携带突变p53的患者中CDKN2A表达量显著上调。综上,p53S通过释放DNA损伤信号和增强基因组不稳定性诱导p19^ARF高表达,高表达的p19^ARF促进MDM2泛素化降解,遏止了MDM2依赖的突变p53泛素化降解途径,导致细胞内积累大量p53S,至此p53S与p19^ARF形成了一个可以相互激活的环路,极大增强了p53S癌基因能力;同时,我们建议,在临床病理诊断中,讨论p19^ARF阳性患者的诊疗方案时一定要结合p53突变情况加以分析。最后,我们针对转录与表达调控谱中出现的PI3K通路条件性表达上调的机制进行了探究。目前关于突变p53与PI3K通路相互作用的研究报道较少,具体机制尚不明确,尤其是突变p53直接调控PI3K通路促进肿瘤形成的机制尚未见报道。本研究结合p53S小鼠肿瘤组织、p53S小鼠肿瘤原代细胞及裸鼠移植瘤模型全面探究了p53S调控PI3K通路的具体机制,在p53S小鼠肿瘤中发现p53S蛋白与AKT磷酸化升高存在相关性;对p53S小鼠肿瘤原代细胞蛋白水平的研究发现,只在p53S小鼠肿瘤细胞中存在p53S高表达促进AKT磷酸化大幅上调的现象,在不能形成肿瘤的p53S小鼠胚胎成纤维细胞中p53S高表达并不能引发AKT磷酸化大幅上调,提示了p53S通过调控AKT磷酸化上调促进肿瘤发生和形成;我们通过细胞克隆形成实验考察稳定敲低p53S对细胞增殖能力的影响,发现与对照组相比,敲低p53S组的克隆数显著减少,提示了敲低p53S显著抑制了肿瘤细胞的增殖能力;最后,我们将稳定敲低p53S的小鼠肿瘤细胞皮下注射给裸鼠,与p53S组对比,稳定敲低p53S的细胞形成肿瘤的速度和体积显著下降。综上,我们证明了:p53S通过直接的蛋白与蛋白相互作用上调AKT磷酸化;p53S通过转录水平的调控,促进m TOR转录和表达;敲低p53S蛋白表达量可以显著性扼制p53S肿瘤的形成。综上所述,我们的研究结果:首先,为之后进一步开展p53S功能获得研究奠定了坚实的基因转录与调控的数据基础;其次,提出了突变p53的一种新功能——突变p53的功能改变与增强机制（Alteration and enhancement of function）;再次,本研究还阐明了一种新的突变p53稳定机制,并据此提出在临床癌症病理诊断中涉及p19^ARF表达的评判时应充分考虑患者p53的突变情况。最后,证明了p53S能够直接调控AKT磷酸化水平和转录激活m TOR的表达促进肿瘤形成,启示了临床癌症靶向PI3K治疗时,要考虑突变p53的调控作用。