研究背景卵巢癌是死亡率最高的女性生殖器官恶性肿瘤,超过70%的患者在诊断时已进入临床晚期。对于接受了满意肿瘤细胞减灭术的患者,中位的总生存期约为57个月,而减瘤手术不满意者的中位生存时间仅在2年内。目前,治疗IC-IV期卵巢癌的规范化方案是在理想肿瘤细胞减灭术的基础上辅助化疗。近20年来,通过全世界妇科肿瘤专家的不懈努力,确立了紫杉醇+铂类的一线联合化疗方案,多项临床研究证明它们优于任何其它方案,但最终仍有超过75%的患者出现肿瘤耐药复发。化疗耐药包括原发耐药和获得性耐药,是制约卵巢癌患者生存率提高的重要原因。原发耐药是指患者在初治时就对化疗药物不敏感,其体内存在固有的耐药肿瘤细胞,在化疗过程中仍不断增殖。获得性耐药多由于个体肿瘤细胞在病变的发展和治疗过程中发生改变,形成新的亚型,最终出现对化疗药物不敏感的临床复发灶。紫杉醇属于生物碱类,是卵巢癌化疗最重要的药物之一,其在细胞的有丝分裂中,主要通过抑制微管解聚破坏肿瘤细胞的增殖。紫杉醇抑制微管解聚的具体机制是,通过结合到游离的微管蛋白诱导和促使微管蛋白装配成稳定微管,同时抑制已形成微管的解聚,从而破坏了细胞有丝分裂功能所必需的微管系统动态再生,导致有丝分裂异常或中断,进而使肿瘤细胞的复制受到阻断而死亡。目前临床上对于卵巢癌耐药的评价主要以停止铂类化疗的间期为标准。与之相适应,大量研究集中在有关铂类耐药的机制,对于同为一线化疗药物的紫杉醇耐药的研究则相对较少。事实上,卵巢癌化疗耐药是一种异质性、多因素的复杂现象,临床上经常可以观察到紫杉醇单药化疗的患者也有耐药现象发生。现有对于卵巢癌耐紫杉醇相关蛋白的研究主要包括P-糖蛋白、微管蛋白、谷胱甘肽转移酶P1等多药耐药相关蛋白,基本来自于人体其它实体瘤的实验数据,其与卵巢癌耐药的相关性存在争论。寻找卵巢癌细胞特异性耐紫杉醇相关蛋白,对于深化有关紫杉醇耐药机理的研究,指导临床化疗方案的制定具有重要意义。本课题组受国家自然科学基金资助,在获得卵巢癌细胞系SKOV3和A2780对紫杉醇耐药型细胞株的基础上,以其作为体外化疗耐药的模型,运用高通量、高分辨率、高准确度的胍基化修饰的乙酰化稳定同位素标记法、液相色谱一傅立叶变换离子回旋共振质谱和定量分析软件MSAQ联用的定量蛋白质组策略,筛选出卵巢癌对紫杉醇耐药相关蛋白mimitin和14-3-3ζ/δ,这两种蛋白在耐药细胞中均有显著下调。其中,mimitin蛋白在SKOV3敏感细胞和耐药细胞的比例为7.4倍,在A2780敏感细胞和耐药细胞的比例为12倍；14-3-3ζ/δ在SKOV3敏感细胞和耐药细胞的比例为4.3倍,在A2780敏感细胞和耐药细胞的比例为3.4倍。本研究在前期蛋白质组学研究的基础上,以卵巢癌紫杉醇耐药细胞株TR-SKOV3为研究对象,采用Western blot法验证了mimitin和14-3-3ζ/δ在耐紫杉醇细胞株中的表达情况。通过siRNA技术分别下调mimitin和14-3-3 ζ/δ在SKOV3和TR-SKOV3细胞株中的表达后,检测耐紫杉醇细胞株耐药指数的改变,并以RT-PCR的方法观察了相关耐药基因表达的变化。进一步收集临床标本和资料,采用免疫组化的方法检测了初治卵巢癌患者的组织学标本中mimitin和14-3-3ζ/δ表达,结合临床资料分析,分别探讨了该两种蛋白表达对于临床卵巢癌紫杉醇耐药的影响,以及在卵巢癌患者中的预后价值。研究方法1.采用MTT法测定紫杉醇耐药卵巢癌细胞株TR-SKOV3的耐药指数,姬姆萨-瑞氏染色比较TR-SKOV3与其亲本株SKOV3形态的差异,7天法细胞计数测定TR-SKOV3生长曲线,比较其与SKOV3生长速度的差异,流式细胞技术测定比较TR-SKOV3与SKOV3的细胞周期的差异。2.采用Western blot方法观察TR-SKOV3与SKOV3中]mimitin和14-3-3ζ/δ蛋白表达差异。通过siRNA技术分别下调SKOV3和TR-SKOV3细胞mimitin和14-3-3ζ/δ表达,以MTT法比较下调后细胞耐药性的改变,验证mimitin和14-3-3ζ/δ蛋白的功能。进一步采用RT-PCR方法比较siRNA干扰前后耐药相关基因的表达改变,分析其可能相关的耐药机制。3.收集71例初治卵巢癌患者原发肿瘤组织及病历资料,采用免疫组织化学法检测mimitin和14-3-3 ζ/δ的表达,同时对这71例患者进行临床随访,分析mimitin和14-3-3 ζ/δ蛋白表达与患者对化疗的反应,以及与临床预后的相关性,进一步验证这两个蛋白对于判断卵巢癌患者预后的价值。研究结果1.MTT法测定TR-SKOV3对紫杉醇的耐药指数为5.59±1.48。姬姆萨-瑞氏染色显示TR-SKOV3细胞与SKOV3之间在形态学上无明显差异。7天法细胞计数显示TR-SKOV3生长速度明显延迟,倍增时间(38.9±5.4)h,约为原代细胞株的1.62倍,差异有显著性意义(P=0.032)。TR-SKOV3细胞的G0/G1期细胞占60.18±1.55%,较SKOV3细胞株增多(P<0.001),S期细胞23.02±3.05%,较SKOV3细胞株减少(P=0.003),G2/M期细胞16.80±1.51%,与SKOV3细胞株无差异(P=0.430)。2. Western blot法显示,与SKOV3细胞相比,mimitin和14-3-3ζ/δ在紫杉醇耐药的TR-SKOV3细胞中表达明显降低。SiRNA成功转染至SKOV3和TR-SKOV3细胞,下调了mimitin和14-3-3ζ/δ的表达,SKOV3的IC50均值分别为7.78±0.87 μg/ml与10.70±0.43 μg/ml, TR-SKOV3细胞的IC50均值分别为9.22±2.08 μg/ml;和13.34±3.43 μg/ml.转染mimitin或14-3-3ζ/δ的siRNA后,SKOV3细胞的耐药指数为转染前的4.03±0.79和6.25±1.79倍。TR-SKOV3细胞的耐药指数为转染前的1.93±0.41和2.42±0.51倍,差异均有统计学意义(分别为P=0.043,P=0.022)。RT-PCR检测转染前后耐药相关基因的表达发现TR-SKOV3较SKOV3细胞的MDR/TAP、GSTP1耐药基因表达增强,而当转染mimitin或14-3-3 ζ/δsiRNA后,GSTP1基因扩增进一步增强。3.对71例初治卵巢癌肿瘤的病理切片行免疫组化检测mimitin和14-3-3ζ/δ蛋白表达,化疗敏感组中,mimitin低表达有9例,占16.1%(9/56),耐药组中,mimitin低表达有10例,占66.7%(10/15),两组比较有显著差异(x2=15.453,P<0.001)。同样,化疗敏感组中,14-3-3ζ/δ低表达有7例,占12.5%(7/56),耐药组中,14-3-3ζ/δ低表达有11例,占73.3%(11/15),两组比较亦有显著差异(χ2= 23.135,P= 0.001)。Kaplan-Meier生存分析,Log-rank检验显示,mimitin蛋白高表达与低表达组的中位PFS分别为17月和6月,OS分别为48月和15月。14-3-3ζ/δ蛋白高表达与低表达组的中位PFS分别为17月和10月,OS分别为52月和30月。不同mimitin和14-3-3ζ/δ蛋白表达的组间生存有显著差异(mimitin:PFS:P= 0.002, OS:P=0.001; 14-3-3 ζ/δ:PFS:P=0.028; OS:P=0.014).多因素分析结果显示FIGO分期、残存肿瘤直径大小、mimitin和14-3-3ζ/δ蛋白的表达是影响PFS和OS的重要预后因素。Mimitin和14-3-3 ζ/δ蛋白低表达的患者生存时间显著缩短(mimitin: PFS:HR 2.11,95% CI 1.03-4.33, P=0.041, OS:HR 3.96,95% CI 1.59-9.90, P = 0.003;14-3-3ζ/δ8:PFS:HR 2.29,95% CI 1.14-4.62, P=0.031, OS:HR 2.88, 95% CI 1.28-6.51, P=0.011).结论1.卵巢癌耐紫杉醇细胞株TR-SKOV3经历诱导后的近10年时间,对于紫杉醇仍然具有耐药性,镜下形态与SKOV3目似,G0/G1期延长,S期缩短,群体倍增时间长,具有耐药细胞的特点,可作为卵巢癌紫杉醇耐药研究的体外模型。2. Mimitin和14-3-3 ζ/δ下调能增强卵巢癌耐药细胞株对紫杉醇耐药性,是重要的紫杉醇耐药相关蛋白,其影响耐药通路可能与GSTP1有关。3. Mimitin和14-3-3ζ/δ蛋白在临床化疗耐药的卵巢癌患者中表达降低,mimitin和14-3-3 ζ/δ低表达是影响患者PFS和OS的独立预后因素。深入对于mimitin和14-3-3ζ/δ蛋白的功能研究,可能为临床改善卵巢癌对紫杉醇耐药提供新的靶点。