甘蓝型油菜细胞核雄性不育系7365A由于能够产生全不育群体,恢复源广,易获得强优势组合,在油菜杂种优势育种中被广泛利用。7365A的育性受两对基因(Bnms3和BnRF)互作控制。为揭示7365A的雄性不育机理,本研究通过图位克隆的方法分离了7365A的育性恢复基因BnaC9.Tic40(BnMS3),并对Tic40在芸薹科中进化模式进行详细分析。同时,利用细胞学和分子生物学方法,阐述了7365A的雄性不育机理及BnaC9.Tic40在油菜花药发育中的功能。主要研究结果如下：1.甘蓝型油菜7365A败育的细胞学观察透射电镜结果表明,7365A花药的绒毡层细胞在减数分裂时期异常膨大。在四分体阶段,7365A绒毡层细胞液泡化且细胞壁完整,质体、内质网、分泌小泡稀少。随着花药发育,7365A的绒毡层质体中没有脂质积累,且四分体周围的胼胝质壁也无法降解。最终,小孢子以四分体的形式被瓦解。脂染色和TUNEL实验表明,在整个花药发育期间7365A绒毡层质体中始终无法合成和积累脂质；绒毡层细胞PCD被延迟。以上研究表明,7365A花药的败育发生在减数分裂时期,由于绒毡层细胞无法向分泌型转移,导致其分泌功能缺失,从而导致不育。具体表现为绒毡层质体中脂类合成异常、胼胝质酶分泌缺失、PCD延迟等。2.恢复基因BnaC9.Tic40的克隆本研究结合芸薹科基因组信息,通过IP标记的开发以及两个BnMs3/Bnms3的近等基因系群体的筛选,将BnMs3定位在分子标记IP20和IP17之间。随后,利用甘蓝和甘蓝型油菜Tapidor的BAC文库构建了BnMs3定位区间的BAC重叠群,完成BnMs3物理图谱的构建。最近两个标记间的物理距离为49.279Kb。对这49.279Kb序列进行ORF分析,获得4个候选基因。这4个候选基因的遗传转化实验最终确定,与拟南芥Tic40(at5g16620)同源的基因BnaC9,Tic40即是7365A的恢复基因BnMs3。3.恢复基因BnaC9.Tic40的表达和功能研究RT-PCR结果表明BnaC9.Tic40在油菜幼苗、花药和授粉20天后的种子中表达较强。利用启动子分析和RNA原位杂交实验对BnaC9.Tic40在花药中的表达进行详细分析,结果表明：BnaC9.Tic40在花药发育第5期开始在绒毡层和花粉母细胞中表达；在四分体时期达到最强；随着小孢子发育和绒毡层降解,表达逐渐降低；直至花粉成熟,表达消失。亚细胞定位实验表明,BnaC9.Tic40定位在原生质体的叶绿体上。而其同源基因,AtTic40是叶绿体内膜上通道蛋白复合体的成员,参与叶绿体内膜上蛋白的转运。据此推测,BnaC9.Tic40主要参与绒毡层质体上蛋白的转运。4.芸薹属基本种中Tic40的复制和丢失由于芸薹族祖先种基因组的三倍化,Tic40基因组区域发生了3次重复。随后,在芸薹族祖先种染色体二倍化过程中,这3次重复的Tic40基因组区域中出现了频繁的基因片段化现象,导致甘蓝C3和白菜A3中对应的Tic40位点被丢失。最终,在芸薹属三个基本种中进化出两个Tic40位点。5.部分同源染色体(A10和C9)的重组导致BnaC9.Tic40(BnMs3)起源于BolC9.Tic40,而bnac9.tic40(Bnms3)起源于BraA10.Tic40Tic40的进化树和序列一致性分析表明恢复基因BnaC9.Tic40在进化上起源于BolC9.Tic40,而其等位基因bnac9.tic40则起源于BraA10.Tic40。23个BnaC9.Tic40和bnac9. tic40侧翼基因序列与甘蓝C9和白菜A10基因组中同源序列的核苷酸多态性分析则证明,在甘蓝型油菜7365B中N19上Tic40周围区域发生了部分同源染色体(A10和C9)的重组,导致7365A中N19连锁群上Tic40位点周围约2Mb的序列来源于白菜A10基因组,从而使bnac9.tic40起源于BraA10.Tic40。6.正向选择使芸薹属基本种中Tic40发生功能分歧,导致BolC9.Tic40发生功能获得型变异芸薹属三个基本种及拟南芥中Tic40拷贝的功能分析表明,相对于芸薹科祖先Tic40而言,甘蓝BolC9. Tic40发生了功能获得型变异。6个可能造成功能变异的氨基酸位点存在其功能结构域TPR和Hop上,导致BolC9.Tic40及BnaC9.Tic40可以恢复由于显性基因BnRf的效应引起的7365A的不育性,且Tic40的这一功能获得型变异仅存在于甘蓝及甘蓝的衍生种中。而对芸薹科中Tic40的选择压力分析表明,在芸薹属三个基本种分化前,芸薹科中Tic40的分子进化表现为较强的纯化选择。在三个基本种分化后,在甘蓝BolC9.Tic40这一进化分枝中表现出明显的正向选择。且6个可能造成功能分歧的氨基酸位点受到正向选择的概率均超过90%,其中3个位点正向选择概率大于99%。