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背景KZNF蛋白是哺乳动物体内最大的转录调控因子家族,它的蛋白结构中包括KRAB结构域和多个锌指结构。锌指结构近似一个手型,可以与目的基因特异结合,一个锌指结构可以与3~4核苷酸相互作用,不同锌指结构结合的DNA序列不同。KRAB结构域能够募集组蛋白甲基化转移酶、组蛋白去乙酰化酶、异染色质蛋白等抑制细胞转录。KZNF蛋白通过锌指结构与靶基因结合,再通过KRAB结构域抑制靶基因转录,参与细胞生命活动的调控。KZNF蛋白具有抑制RNA聚合酶I、II和III引物的转录,调控核仁功能,结合与剪接RNA的功能。Apak蛋白是本实验室发现与研究的一种KZNF蛋白,由ZNF420基因编码,是抑癌蛋白p53的负调控分子。在正常细胞中,Apak通过辅抑制蛋白KAP1聚集组蛋白去乙酰化酶HDAC1和ATM激酶与p53结合形成复合体,使p53的乙酰化水平下调,抑制p53相关的凋亡靶基因表达,抑制细胞凋亡,而对p53参与的其它生理功能没有明显的调控作用。在烷化剂MMS诱导的DNA损伤情况下,ATM被激活,Apak的Ser68位点发生磷酸化,磷酸化状态的Apak与p53解离,解除了对p53的抑制作用,p53激活,细胞凋亡。目的探讨作为KZNF家族的Apak蛋白是否有不依赖于p53的其它作用机制,Apak蛋白对细胞生长增殖有什么作用,Apak蛋白的表达与肿瘤有怎样的相关性,希望为肿瘤的早期诊断和防治提供新的预警分子。方法本实验采取病例对照研究设计,选取15例胃癌患者和20例结直肠癌患者肿瘤样本作为病例组,同一患者的肿瘤旁正常组织作为对照组,采用Westernblotting方法检测肿瘤组织中Apak蛋白的表达水平。培养H1299细胞,转染GFP-C3,GFP-Apak,shRNA-con,shRNA-Apak四种质粒,采用实时荧光定量PCR的方法检测rRNA的水平,采用流式细胞检测细胞周期,采用MTT方法检测细胞增殖,采用ChIP方法检测与Apak蛋白结合的DNA序列,并对结果进行分析。结果1、对本实验人群中的15例胃癌患者及20例结直肠癌患者的组织标本,采用Western blotting方法检测Apak蛋白表达水平,发现对于同一患者,与肿瘤旁正常组织相比,肿瘤组织中Apak蛋白水平下调,并且,p53突变的细胞中,Apak蛋白下调水平更显著,说明Apak蛋白在肿瘤组织中有不依赖于p53的其它作用机制。2、分四个培养瓶培养H1299细胞,分别转染GFP-C3,GFP-Apak,shRNA-con,shRNA-Apak四种质粒,转染48小时后,收细胞,提取细胞RNA,利用实时荧光定量PCR检测rRNA的表达水平,利用Western blotting方法检测Apak蛋白的表达水平,结果发现Apak蛋白能够抑制rRNA的合成。3、分两个培养瓶培养H1299细胞,分别转染GFP-C3,GFP-Apak两种质粒,48小时候后收细胞,使用流式细胞仪检测细胞周期,结果发现,Apak蛋白使大部分H1299细胞在G1期阻滞。4、在H1299细胞中,分别转染GFP-C3,GFP-Apak,shRNA-con,shRNA-Apak四种质粒,转染48h后,G418处理,2~3周后获得稳定表达Apak和稳定敲低Apak的细胞系,利用MTT方法检测细胞的增殖,结果发现Apak蛋白抑制细胞生长。5、利用染色质免疫沉淀方法(ChIP)发现Apak能够与45SpreRNA的调控区结合,其结合的DNA序列是TCTTN2-30TTGT。6、设置三个实验组,每组含有两瓶分别转染了shRNA-con和shRNA-Apak质粒的H1299细胞,第一组作为对照组,不加任何药剂;第二组加入TSA;第三组加入5’-Aza,一段时间后收细胞,提取细胞RNA,利用实时荧光定量PCR检测preRNA的水平。结果表明Apak能够使rRNA调控区发生甲基化,即Apak对rRNA调控区存在表观遗传学修饰。结论1、在肿瘤组织中Apak蛋白水平下调,并且,p53突变的细胞中,Apak蛋白下调水平更显著。2、Apak蛋白能够与45SpreRNA的调控区结合。3、Apak蛋白能够使rRNA调控区发生甲基化,即Apak对rRNA调控区存在表观遗传学修饰。4、Apak蛋白能够抑制rRNA的合成。5、Apak蛋白能够抑制细胞增长,使细胞在G1期阻滞。