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1型强直性肌营养不良症(Myotonic dystrophy type1, DM1)是一种常染色体显性遗传病,其症状包括肌强直、肌肉萎缩、心脏传导缺陷、胰岛素耐受、白内障和认知缺陷等。DM1是最常见的成人肌营养不良症,全球发病率大概是1/8000。DM1是由于位于19q13.3染色体上的强直性肌营养不良蛋白激酶(myotonic dystrophy protein kinase, DMPK)基因3’端非翻译区的CTG重复序列异常扩增所致。DM1的发病机制尚不完全清楚,目前普遍认为是DMPK的mRNA发生了功能获得性突变,即异常扩增的CTG转录成有毒性的CUG RNA重复序列,并与一些转录因子和可变剪接调控因子等结合,形成核内聚集体(foci),滞留在细胞核内,从而破坏基因的正常表达和可变剪接。目前研究最清楚的两类受CUG重复序列影响的剪接调控因子：Muscleblind样蛋白家族和CUG-BP, Elav-like蛋白家族,它们的异常表达造成许多下游目的基因的可变剪接发生异常。虽然通过反义寡核苷酸和RNAi等方法,DM1的症状可以得到一定的缓解,但到目前为止还不能完全治愈。我们探索一种利用人造特异性RNA内切酶(artificial site-specific RNA endonucleases, ASREs)治疗DM1的新方法。首先,通过重新编码得到特异性识别CUG重复序列的PUF结构域,并通过酵母三杂交系统和凝胶迁移实验进行验证；其次,通过将重新编码的PUF结构域与PIN结构域(RNA内切酶结构域)融合得到ASREs,其能够在培养细胞中特异性降解异常扩增的CUG重复序列；再次, ASREs的表达能够显著性减少DM1病人细胞中核内聚集体的数量；此外,ASREs的表达能够有效地逆转DM1病人细胞中IR、BIN1、cTNT、Nfix、SMYD1和SERCA1基因的异常剪接。总之,ASREs为DM1治疗提供了一种新的基因治疗策略。ASREs在DM1病人细胞中的应用取得了令人满意的效果,然而由于天然PUF结构域含有8个重复序列,即只能识别8个连续的RNA碱基,导致ASRE识别靶标序列的特异性有限,可能存在脱靶的现象,因此我们进一步研究并优化PUF结构域的RNA结合特性。首先,通过增加重复序列的数量来提高PUF结构域的结合特性,随着重复序列数目的增加,PUF结构域激活下游报告基因的能力也随之增强,当重复序列数目达到9时, LacZ活性达到顶峰；其次,通过改良PUF结构域,得到了结合RNA能力更强的PUF结构域。通过对PUF结构域结合特性的改造和优化,将为模块化的PUF结构域的应用打下基础。