昆虫病原真菌广泛用于农林害虫的防治,由于其环境安全性、强致病性以及潜在的流行性,成为很有应用潜力的生物制剂。罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robberstii)作为一种昆虫病原菌的模式生物,一直在昆虫病原真菌的遗传调节机制、致病机制及生物防治方面的研究中走在前列。类胶原蛋白(collagen-like protein)基因存在于病毒、细菌和真核生物内,在调控生物生长发育、代谢途径和致病性等方面发挥重要作用。本实验室的前期研究表明,分析热激处理的绿僵菌孢子转录组表达谱,在所有上调的基因中,一种类胶原蛋白的基因表达上调幅度位居前三,我们推测类胶原蛋白可能在绿僵菌的抗逆过程起着较为重要的作用。为此,本文对罗伯茨绿僵菌内类胶原蛋白基因(Mcl2)的功能进行了较为系统的研究,意在阐明Mcl2的遗传信息,并明确该基因在抗逆、生长发育以及杀虫能力等方面的作用,为人工创制高效杀虫转基因绿僵菌菌株提供新基因储备。本研究首先对绿僵菌类胶原蛋白基因克隆注释,获得Mcl2遗传信息;其次利用同源重组的原理,运用农杆菌介导的绿僵菌遗传转化方法,获得该基因的敲除菌株及回补菌株。最后,通过对野生型菌株、敲除突变体菌株和回补突变体菌株表型的分析,获得Mcl2功能特征。具体的研究结果如下:(1)通过RACE克隆与测序方法,得到了Mcl2的cDNA全长序列,并对其进行生物学信息注释,而且通过在GenBank数据库中进行Blast比对和构建系统发育树,表明本研究的这种罗伯茨绿僵菌基因(Mcl2)可能是一种新的类胶原蛋白基因。(2)通过构建重组质粒pDHt-SK-Mcl2L-BAR-Mcl2R和pDHt-SK-Mcl2-BEN,再利用农杆菌介导和同源重组基因敲除的方法,最后成功得到?Mcl2(敲除突变体)和?Mcl2/Mcl2(回补突变体)。(3)比较WT(野生型菌株)、?Mcl2(敲除突变体)和?Mcl2/Mcl2(回补突变体)之间的生物学性状表明:在PPDA、PDA、SDAY和1/4SDAY培养基上,敲除突变体的菌落颜色和形态、菌丝生长速度与野生型菌株相比均无显著差异;而SDAY、1/4SDAY、PPDA及PDA培养基的产孢量略低于野生型菌株,分别为下降了8.34%、9.27%、8.45%和9.89%,?Mcl2/Mcl2与WT的产孢量基本一致。(4)对上述3个菌株的逆境胁迫分析表明:它们的分生孢子38°C热激处理2 h,发现敲除Mcl2后,其分生孢子的萌发率降为40.19%,与野生型菌株相比降低了34.79%,表明缺失Mcl2的菌株对外界温度的变化更敏感。而对分生孢子紫外照射3 min,敲除菌株分生孢子萌发率为56.48%,较野生型菌株和回补菌株分别减少9.45%和9.10%,并没有明显变化。在化学试剂胁迫研究中发现,在加入多菌灵、H2O2、SDS、Congo Red等不同化学物质的PDA培养基中,敲除突变体的生长状况与野生型亦无明显差异。(5)用这3种不同菌株的分生孢子(107 conidia/mL)侵染大蜡螟,与野生型绿僵菌相比,敲除了Mcl2的绿僵菌侵染能力明显减弱,在第5天致死率下降了49.74%,且半致死的时间为7.47±0.7天,相对延长了2天,说明Mcl2的缺失导致毒力的减弱。综上所述,这种类胶原蛋白Mcl2的缺失对罗伯茨绿僵菌的菌丝生长发育和抗化学胁迫、紫外以及产孢均无明显影响,然而数据显示该基因可能在适应热激环境能力和杀虫能力方面起重要作用。