目的:探讨铁死亡(Ferroptosis)在铝致神经元死亡中的作用,明确铝致神经元ferroptosis的分子机制,为进一步研究铝的神经毒性提供理论依据。方法:1.确定麦芽酚铝(aluminum maltolate,Al(mal)3)染毒剂量和染毒时间分别以含终浓度为0、50、100、200和400μmol/L Al(mal)3的高糖DMEM培养基处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma-derived cell,PC12)细胞12 h、24h和48 h,采用CCK-8法测定细胞活力,并确定最终的Al(mal)3染毒剂量和染毒时间。2.实验分组及指标测定按照确定的染毒剂量和染毒时间,将PC12细胞分为10组,分别为0μmol/L Al(mal)3组(空白对照组)、200μmol/L Al(mal)3组、0.5%DMSO组(溶剂对照组)、5μmol/L Erastin组、5μmol/L ferrostatin-1(Fer-1)组、200μmol/L deferoxamine(DFO)组、200μmol/L Al(mal)3+0.5%DMSO组、200μmol/L Al(mal)3+5μmol/L Erastin组、200μmol/L Al(mal)3+5μmol/L Fer-1组和200μmol/L Al(mal)3+200μmol/L DFO组。DMSO是ferroptosis激动剂Erastin和ferroptosis拮抗剂Fer-1、DFO的溶剂。联合染毒组先加入DMSO或ferroptosis干预剂预处理PC12细胞2 h,再加入Al(mal)3至终浓度为200μmol/L,培养24 h后,采用倒置显微镜观察PC12细胞形态;采用CCK-8法检测PC12细胞活力;收集细胞后采用透射电镜观察PC12细胞超微结构;采用微板法检测PC12细胞谷胱甘肽(glutataione,GSH)含量;采用比色法检测PC12细胞谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活力和细胞内铁含量;采用流式细胞术检测PC12细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)法检测ferroptosis相关基因胱氨酸/谷氨酸反向转运体(cystine/glutamate transporter,System Xc-)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)、二价金属离子转运体(divalent metal transporter 1,DMT1)和铁蛋白重链(ferritin heavy chain 1,FTH1)m RNA表达水平;采用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测ferroptosis相关蛋白SLC7A11、GPX4、TFR1、DMT1和FTH1蛋白表达水平。结果:1.确定Al(mal)3染毒剂量和染毒时间与空白对照组相比,不同浓度Al(mal)3染毒12 h后,各组PC12细胞存活率没有明显变化(P(29)0.05);染毒24 h和48 h后,PC12细胞存活率随染毒剂量的增加呈下降趋势,其中200μmol/L Al(mal)3组和400μmol/L Al(mal)3组PC12细胞存活率显著降低(P<0.05)。通常情况下,选择细胞存活率在70~80%之间的染毒浓度进行细胞毒性实验,本研究显示,200μmol/L Al(mal)3染毒24 h后PC12细胞存活率为(74.93±0.08)%,因此最终确定的染毒剂量为200μmol/L Al(mal)3,染毒时间为24 h。2.Ferroptosis在铝致PC12细胞死亡中的作用细胞活力检测发现,与空白对照组相比,Al(mal)3组PC12细胞存活率(74.39±0.02)%明显下降(P<0.05);与DMSO组相比,Fer-1组PC12细胞存活率无明显变化,Erastin组、DFO组和Al(mal)3+DMSO组PC12细胞存活率明显下降(P<0.05);与Al(mal)3+DMSO组PC12细胞存活率(66.70±0.02)%相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞存活率(47.24±0.05)%明显下降(P<0.05),Al(mal)3+Fer-1组PC12细胞存活率(91.10±0.02)%和Al(mal)3+DFO组PC12细胞存活率(95.85±0.08)%明显升高(P<0.05)。倒置显微镜观察发现,与空白对照组相比,Al(mal)3组PC12细胞数量明显减少,细胞变圆,细胞间连接减少。与DMSO组相比,Fer-1组PC12细胞数量无明显变化,细胞状态良好;Erastin组、DFO组和Al(mal)3+DMSO组PC12细胞数量明显减少,细胞变小变圆。与Al(mal)3+DMSO组相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞数目明显减少;Al(mal)3+Fer-1组和Al(mal)3+DFO组PC12细胞数目增加,细胞状态明显改善。透射电镜观察显示,Al(mal)3染毒可使PC12细胞出现线粒体体积缩小,双层膜密度增加等ferroptosis特征性表现;出现染色质边集,形成凋亡小体等凋亡特征;出现自噬特征性表现,如形成双层膜自噬小体;以及出现坏死的特征,如核染色体降解,核膜溶解。进一步观察线粒体超微结构发现,与空白对照组相比,Al(mal)3组PC12细胞线粒体体积明显缩小,双层膜密度增加,线粒体嵴减少或消失,部分线粒体外膜破裂。与DMSO组相比,Erastin组和Al(mal)3+DMSO组PC12细胞线粒体体积变小,双层膜密度增加;而Fer-1组和DFO组线粒体形态正常,结构完整。与Al(mal)3+DMSO组比较,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞线粒体损伤加重,外膜破裂严重;而Al(mal)3+Fer-1组和Al(mal)3+DFO组PC12细胞线粒体损伤明显减轻,线粒体形态结构趋于正常状态。Ferroptosis相关生化指标检测发现,与空白对照组相比,Al(mal)3组PC12细胞内GSH含量(22.41±2.86μmol/gprot)和GSH-PX活力(106.21±5.20活力单位/mgprot)均显著下降(P<0.05);与DMSO组相比,Erastin组PC12细胞GSH含量和GSH-PX活力均明显降低(P<0.05),Fer-1组和DFO组PC12细胞GSH-PX活力明显下降(P<0.05),Al(mal)3+DMSO组PC12细胞GSH含量(18.96±2.00μmol/gprot)和GSH-PX活力(89.98±4.95活力单位/mgprot)也明显下降(P<0.05);与Al(mal)3+DMSO组比较,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞GSH含量(11.27±0.68μmol/gprot)和GSH-PX活力(66.92±1.87活力单位/mgprot)显著下降(P<0.05);Al(mal)3+Fer-1组PC12细胞GSH含量(24.16±1.22μmol/gprot)和GSH-PX活力(102.64±4.05活力单位/mgprot)明显升高(P<0.05);Al(mal)3+DFO组PC12细胞GSH含量(22.71±1.79μmol/gprot)和GSH-PX活力(116.05±3.83±1.87活力单位/mgprot)明显升高(P<0.05)。与空白对照组相比,Al(mal)3组PC12细胞内铁离子含量(38.43±3.94μmol/gprot)明显升高(P<0.05);与DMSO组相比,Erastin组、Fer-1组和DFO组PC12细胞内铁离子含量均无显著差异,而Al(mal)3+DMSO组PC12细胞内铁离子含量(35.71±12.00μmol/gprot)明显升高(P<0.05);与Al(mal)3+DMSO组相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞内铁离子含量(31.69±15.24μmol/gprot)无明显变化(P>0.05);Al(mal)3+Fer-1组PC12细胞内铁离子含量(22.62±6.29μmol/gprot)下降但差异无统计学意义(P>0.05);Al(mal)3+DFO组PC12细胞内铁离子含量(19.72±4.39μmol/gprot)明显下降(P<0.05)。与空白对照组相比,Al(mal)3组PC12细胞ROS荧光强度(81.45±6.20)明显升高(P<0.05);与DMSO组相比,Erastin组PC12细胞ROS荧光强度明显升高(P<0.05),Fer-1组ROS荧光强度明显下降(P<0.05),DFO组ROS荧光强度无明显变化,Al(mal)3+DMSO组PC12细胞ROS荧光强度(76.00±5.98)升高,但无统计学差异(P>0.05);与Al(mal)3+DMSO组相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞ROS荧光强度(109.82±8.15)明显升高(P<0.05),Al(mal)3+Fer-1组(60.19±2.81)和Al(mal)3+DFO组(53.94±13.20)PC12细胞ROS荧光强度明显下降(P<0.05)。3.铝致PC12细胞ferroptosis相关机制氧化损伤相关机制研究结果显示,Al(mal)3染毒PC12细胞24 h后SLC7A11蛋白和m RNA表达较空白对照组下降,但差异无统计学意义(P>0.05);与DMSO组相比,Erastin组PC12细胞SLC7A11蛋白表达明显下降(P<0.05),而m RNA表达明显上升(P<0.05),Fer-1组和DFO组PC12细胞SLC7A11蛋白和m RNA表达均无统计学差异,Al(mal)3+DMSO组PC12细胞SLC7A11蛋白表达显著下降(P<0.05),SLC7A11 m RNA表达也下降,但差异无统计学意义(P>0.05);与Al(mal)3+DMSO组相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞SLC7A11 m RNA表达明显升高(P<0.05);Al(mal)3+Fer-1组SLC7A11蛋白表达明显升高(P<0.05);Al(mal)3+DFO组SLC7A11蛋白和m RNA表达均明显升高(P<0.05)。Al(mal)3组PC12细胞较空白对照组GPX4蛋白表达下降,但差异无统计学意义(P>0.05),GPX4 m RNA表达显著升高(P<0.05);与DMSO组相比,Erastin组PC12细胞GPX4 m RNA表达明显下降(P<0.05),Fer-1组和DFO组PC12细胞GPX4蛋白和m RNA表达均无统计学差异,Al(mal)3+DMSO组GPX4蛋白表达下降,但差异无统计学意义(P>0.05),而GPX4 m RNA表达明显上升(P<0.05);与Al(mal)3+DMSO组相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞GPX4蛋白表达下降,但差异无统计学意义(P>0.05);Al(mal)3+Fer-1组和Al(mal)3+DFO组GPX4蛋白表达上升,但差异无统计学意义(P>0.05),GPX4 m RNA表达明显下降(P<0.05)。铁代谢相关机制研究结果显示,Al(mal)3组PC12细胞TFR1蛋白表达较空白对照组升高,但无统计学差异(P>0.05),而TFR1 m RNA表达显著升高(P<0.05);与DMSO组相比,Erastin组PC12细胞TFR1 m RNA表达明显升高(P<0.05),Fer-1组和DFO组PC12细胞TFR1蛋白和m RNA表达均无明显变化,Al(mal)3+DMSO组PC12细胞TFR1蛋白和m RNA表达均明显上升(P<0.05);与Al(mal)3+DMSO组相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞TFR1蛋白和m RNA表达明显升高(P<0.05);Al(mal)3+Fer-1组和Al(mal)3+DFO组TFR1蛋白和m RNA表达均无明显变化(P>0.05)。Al(mal)3组PC12细胞较空白对照组DMT1蛋白表达显著上升(P<0.05),DMT1m RNA表达也升高,但无统计学差异(P>0.05);与DMSO组相比,Erastin组PC12细胞DMT1蛋白和m RNA表达明显升高(P<0.05),Fer-1组DMT1蛋白和m RNA表达无明显变化,DFO组DMT1蛋白表达明显升高(P<0.05);与DMSO组相比,Al(mal)3+DMSO组DMT1蛋白表达明显升高(P<0.05),m RNA表达也升高,但无统计学差异(P>0.05);与Al(mal)3+DMSO组相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞DMT1m RNA表达上升,但差异无统计学意义(P>0.05),Al(mal)3+Fer-1组DMT1蛋白和m RNA表达明显降低(P<0.05),Al(mal)3+DFO组DMT1 m RNA表达上升,但无统计学差异(P>0.05)。Al(mal)3组PC12细胞较空白对照组FTH蛋白表达升高,但差异无统计学意义(P>0.05),FTH m RNA表达明显升高(P<0.05);与DMSO组相比,Erastin组PC12细胞FTH蛋白和m RNA表达明显升高(P<0.05),Fer-1组和DFO组PC12细胞FTH蛋白和m RNA表达均无明显变化,Al(mal)3+DMSO组PC12细胞FTH蛋白表达升高,但无统计学差异(P>0.05),FTH m RNA表达明显升高(P<0.05);与Al(mal)3+DMSO组相比,Al(mal)3+Erastin组PC12细胞FTH m RNA表达明显升高(P<0.05);Al(mal)3+Fer-1组FTH蛋白表达明显降低(P<0.05);Al(mal)3+DFO组FTH蛋白和m RNA表达均明显降低(P<0.05)。结论:1.铝暴露可诱导神经元发生ferroptosis;2.氧化损伤和铁代谢异常可能是铝致神经元ferroptosis的作用机制;3.Ferroptosis特异性抑制剂Fer-1和铁螯合剂DFO对铝致神经元ferroptosis具有抑制作用。