DNA walker是一类由剪切作用和链置换反应驱动,沿着设计的DNA轨道自主移动的分子机器,其可以实现物质的定向运输,因而可以实现信号的富集与放大。在特异性的金属离子或者其它生物小分子的作用下,DNAzyme核酶链可以切割底物链。DNAzyme具有特异性好、催化活性高、易于功能化、稳定性强等优点。我们将铜核酶和DNA walker结合起来,无需外加蛋白酶,实现了信号的放大作用,设计了一种基于DNAzyme walker电化学传感器。端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶,可以在引物的作用下产生TTAGGG重复序列,并添加到端粒末端,以保护端粒在细胞分裂过程中免受侵蚀。研究表明,端粒酶在大多数癌细胞中表现出很高的活性,而在正常人体细胞中活性很低,所以,端粒酶可作为一种肿瘤标志物,用于癌症的发现,诊断,治疗及术后诊查。因此,开发新型灵敏的电化学方法检测端粒酶活性是很有必要的。铜离子(Cu2+)是人体必需的微量元素之一,参与人体的多种生命活动,如电子转导,酶催化和氧运输等等。人体类Cu2+的浓度与身体健康有很大关系,Cu2+浓度不当会对肾脏,肝脏和神经系统造成严重损害,导致各种疾病(如帕金森,阿尔兹海默症等等)。因此,构建新型的传感方法检测铜离子是至关重要的。本文构建了基于DNAzyme walker电化学传感器用于检测端粒酶活性和铜离子。主要工作内容如下:第二章:构建了一种铜离子DNAzyme walker电化学传感器分析检测端粒酶活性。Y1,Y2和端粒酶的产物由于邻近效应会形成Y形的DNAzyme walker,利用铜离子DNAzyme的特异性识别和切割作用,walker可以自主行走,实现信号的放大。发卡捕获探针HC 5’修饰了巯基基团,3’修饰了二茂铁(Fc),可以自组装在金电极表面,二茂铁可提供氧化还原电信号,HC的环状部分包含铜DNAzyme的底物链。正常的HeLa细胞中,端粒酶活性很高,引物D-TSP会合成一段重复序列,在邻近效应下,其会与Y1和Y2结合形成稳定的Y形的DNA walker,此walker包含三条铜DNAzyme的核酶链,会与底物链进行沃森-克里克碱基配对,在铜离子的作用下,自主的切割HC探针,产生大量的带有二茂铁的片段,这些片段吸附在电极表面,电信号急剧上升。而在加热失活的HeLa细胞中,端粒酶活性很低,引物依然保持短链的结构,在引入Y1和Y2链后,它们具有低的亲和力,不能邻近杂交形成Y形walker,切割效率很低。在优化条件下,该传感器在25-2000个HeLa细胞时,峰值电流与HeLa细胞的对数值呈三次函数关系,相关系数为0.9939,检测限为23个HeLa细胞。该传感器还可以检测MCF-7细胞和A549细胞的端粒酶活性。该检测方法拓宽了 walker的应用研究,可应用于癌细胞的早期诊断,在临床检测上具有潜在的应用价值。第三章:构建了一种铜离子DNAzyme walker的电化学传感器分析检测铜离子。铜DNAzyme只有在铜离子的辅助下,才能切割底物链,Y形的DNA walker包含三条铜DNAzyme的核酶链,walker可以沿着设计的轨道自主行走,实现信号的富集放大。发卡捕获探针HC 5’修饰了巯基基团,3’修饰了二茂铁(Fc),可以自组装在金电极表面,二茂铁可提供氧化还原电信号,HC的环状部分包含铜DNAzyme的底物链。存在目标物Cu2+时,Y形的DNA walker会自主的切割HC探针,产生大量的带有二茂铁的片段,这些片段吸附在电极表面,电信号急剧上升。不存在目标物Cu2+时,DNA walker的活性极低,极少数带有二茂铁的片段吸附在电极表面,电流值几乎不发生变化。在优化条件下,该传感器在Cu2+的浓度为5-500 nM时,峰值电流与Cu2+浓度的对数呈二次函数关系,相关系数为0.9942,检测限为3.834 nM。且该传感器不需要额外加入其他蛋白酶,对Cu2+有良好的选择性,因此,对环境污染物的检测研究有潜在的应用价值。