论文部分内容阅读
目的:脓毒症是一种宿主对感染反应失调的复杂疾病,其发病率与死亡率极高,是全球医务工作者所面临的最艰巨的公共卫生难题之一。最新研究发现中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)在脓毒症的病理生理过程中起着至关重要的作用,适量的NETs通过诱捕并消灭病原体对机体起到保护性作用,而脓毒症中过量的NETs则会引起靶器官损害,甚至导致全身器官功能障碍。甘草甜素(Glycyrrhizin,GL)是一种从甘草中提取的活性成分,具有抗炎、抗病毒、调节免疫、抗变态反应等各种作用,在脓毒症防治中具有潜在的诱人前景。已有研究发现GL减轻了脓毒症导致的肺损伤、肾损伤等器官损伤,但GL在脓毒症中如何发生保护作用,GL是否参与及通过何种机制参与对脓毒症中NETs的调控作用尚未明确。本研究旨在初步探究GL对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激后的类中性粒细胞释放NETs的影响及相关机制,为GL在脓毒症中的保护作用提供理论依据。方法:构建类中性粒细胞(d HL-60)脓毒症模型,通过流式细胞术检测类中性粒细胞CD11b抗原的表达、吉姆萨染色验证类中性粒细胞细胞核分化成分叶核、台盼蓝染色检验类中性粒细胞活性、Western Blot技术检测NETs中关键蛋白Cit-H3蛋白表达确定LPS最佳刺激浓度等方法验证类中性粒细胞脓毒症模型是否构建成功。首先将细胞分为两组:Control组及LPS组,Control组不加入LPS处理细胞,LPS组加入上述最佳刺激浓度的LPS处理细胞,随后处理12h后收集细胞,通过Western Blot检测HMGB1及Cit-H3表达情况。随后将细胞分为三组:Control组、LPS组和LPS+GL组,Control组、LPS组处理方式同上述,LPS+GL组加入相同浓度的LPS和100μg/ml终浓度的甘草甜素处理细胞,处理12h后收集细胞,通过Western Blot技术检测HMGB1的表达情况;采用细胞免疫荧光技术检测NETs关键蛋白Cit-H3蛋白表达情况;采用荧光酶标仪对NETs组成成分游离DNA(Free Deoxyribo Nucleic Acid,Free DNA)进行定量。最后将细胞分为四组:control组、LPS组、HMGB1组和HMGB1+GL组,control组、LPS组处理方式同上述,HMGB1组为在LPS组的基础上加入300ng/ml浓度的重组人HMGB1蛋白,HMGB1+GL组为在HMGB1组的基础上加入100μg/ml终浓度的甘草甜素处理细胞,处理12h后收集细胞,通过Western blot技术检测TLR9表达水平。结果:流式细胞术结果显示诱导5天后d HL-60细胞中CD11b的表达最高,达到95%以上,表明诱导分化5天后的d HL-60细胞具有中性粒细胞分化特征;吉姆萨染色结果显示诱导分化5天后的d HL-60细胞具有典型的中性粒细胞分叶核;台盼蓝染色显示诱导分化5天后的d HL-60细胞活力大于95%;以上实验结果均提示诱导分化5天后的人早幼粒白血病细胞(Human promyelocytic leukemia cells,HL-60)已成功分化为d HL-60细胞。不同浓度的LPS刺激d HL-60细胞后,200ng/ml浓度LPS刺激d HL-60细胞后Cit-H3表达水平最高。因此类中性粒细胞脓毒症模型构建成功。类中性粒细胞脓毒症模型中的Cit-H3、HMGB1的表达水平显著升高。GL进行干预后,类中性粒细胞脓毒症模型中的HMGB1的表达水平明显降低,NETs关键蛋白Cit-H3表达水平明显降低,NETs组成成分free DNA水平明显降低,提示GL减少了类中性粒细胞脓毒症模型中NETs的释放。类中性粒细胞脓毒症模型中的TLR9的表达水平明显升高,给予外源性重组人HMGB1蛋白作用于类中性粒细胞脓毒症模型使TLR9的表达水平进一步升高,给予GL作用可使TLR9表达水平显著降低。结论:LPS诱导d HL-60细胞过度表达HMGB1及过度释放NETs,GL可以抑制LPS诱导d HL-60细胞表达HMGB1并进一步抑制其NETs的释放,GL可能通过HMGB1/TLR9通路抑制了脓毒症中NETs的释放。