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DNA甲基化是哺乳动物细胞中重要的表观遗传学修饰之一，大约70％-80％的CpG发生这种甲基化修饰。甲基化调节许多细胞生物学过程，对于哺乳动物的生长发育十分关键。异常的甲基化在许多癌症中频发，在这些细胞中肿瘤抑制基因启动子区CpG岛的高甲基化可使其失活。DNA甲基化信号由甲基化结合蛋白MBD来转译，它们能够特异性识别并结合至甲基化位点通过募集辅阻遏复合物例如组蛋白去乙酰化酶(HistoneDeacetylase，HDAC)建立沉默的染色质，从而在DNA甲基化和基因沉默中起到桥梁作用。 因此，MBD蛋白发挥转录抑制功能的关键在于它能够特异性识别并结合至甲基化DNA位点。然而，MBD蛋白是高度碱性的蛋白，比如MBD2（pI大约为10），在生理条件下很容易通过自身正电荷和未甲基化DNA负电荷的静电吸引产生非特异性结合。那么在含有大量未甲基化DNA的情况下，蛋白是如何特异性的识别并结合至甲基化位点进而发挥其功能呢？而MBD蛋白-甲基化DNA相互作用的研究是阐明这一科学问题的关键，为更加深入的理解MBD蛋白特异性识别甲基化DNA提供新的视角。 另一方面，毛细管电泳-激光诱导荧光(Capillary Electrophoresis-Laser-InducedFluorescence，CE-LIF)由于分析速度快、分离效率高、灵敏度高以及只有nL级别的样品消耗使得它成为研究蛋白-DNA相互作用的强大分析工具。而且，毛细管电泳已应用于研究计量学、离解动力学、大分子构象变化以及测定各种亲和相互作用结合参数。 本论文利用毛细管电泳-激光诱导荧光CE-LIF装置，通过设计不同长度、不同甲基化密度修饰的DNA探针，系统的研究了MBD2b蛋白与甲基化DNA相互作用的结合计量学、动力学以及识别特异性，同时，对高亲和力、高特异性甲基化白探针的开发方面也开展了有益的探索。全文共分五个章节: 第一章综述DNA甲基化及其生物学功能、DNA异常甲基化在癌症等疾病发生过程中的作用，较为详细的介绍了甲基化结合蛋白的结构、功能以及目前的DNA甲基化检测方法。 第二章构建并在大肠杆菌中表达MBD2b和SNAP-MBD2b蛋白，并开发出有效的两步法来纯化这两种蛋白，纯化方法包括组氨酸标签亲和层析(Histidine-tagged AffinityChromatography，AC)和阳离子交换层析(Cation Exchange Chromatography，CEC)两步。采用该两步法所获得的MBD2b和SNAP-MBD2b蛋白能够达到高纯度(＞93％)，同时可以很好地保持目标蛋白的活性。跟MBD2b相比，融合了SNAP标签之后不仅显著增强了MBD2b蛋白的表达，同时也降低了它在阳离子交换树脂上的吸附，因而提高了MBD2b蛋白的纯化效率。有趣的是，这两个蛋白对盐高度敏感，都需要高浓度的NaCl(0.3M)来防止它们的聚集。 第三章研究了MBD2b蛋白与甲基化DNA相互作用的计量学和识别特异性。结果表明尽管MBD2b蛋白能够以DNA链长依赖的方式结合甲基化DNA，多个MBD2b蛋白同时结合至一个DNA分子上消除了识别特异性，但大量存在的未甲基化DNA的竞争能够消除多个蛋白的结合使得蛋白对于一对甲基化DNA探针的计量学简化为1∶1，从而增加识别的特异性，因此，一对甲基化的CpG即可驱动特异性结合。本论文首次从结合计量学的角度表明MBD2b蛋白识别甲基化DNA时是怎样从多个非特异性的结合到特异性的捕获甲基化位点的动态过程，清楚的表明了结合计量学对于甲基化引发的识别特异性的贡献。本研究不仅为结合计量学提供了新的视角同时也深化了对于甲基化特异性识别机制的理解;另一方面，研究也揭示了如何改善基于MBD2b蛋白的DNA甲基化检测当中引起的非特异性捕获的问题。 第四章对设计和合成高亲和力高特异性甲基化蛋白探针开展了有益的探索。将MBD2b和MBD3L1这两个蛋白串联表达，结果表明串联之后的MBD2b-MBD3L1的识别特异性要好于MBD2b蛋白。 第五章总结了所开发出的MBD2b蛋白纯化方法以及MBD2b蛋白和甲基化DNA相互作用的计量学和识别特异性。