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食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，占恶性肿瘤发病率的第6位，死亡率为第4位，在亚洲国家中食管鳞癌占90％。目前，对食管癌的癌变机制研究取得了一定的进展，但具体分子机理仍不清楚。近年来研究发现某些肿瘤抑制基因其DNA序列完整，并未有突变、缺失等变化，用经典的遗传调控理论难以解释抑癌基因失活的现象，逐渐认识到Epigentics（表观遗传学）参与肿瘤的发生和发展，主要包括DNA甲基化和组蛋白去乙酰化，其中DNA甲基化是表观遗传调控的重要方式。近年来研究遍认为DNA甲基化是肿瘤抑制基因失活的主要原因，是抑癌基因失活的第三条途径，在某些情况下甚至可能为调控基因转录的唯一的机制。最近研究发现RUNX3是一个新的候选抑癌基因，在人类肿瘤细胞系或肿瘤组织如胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌中表达下调或缺失，而RUNX3基因启动子区高甲基化是导致RUNX3表达失活的主要原因之一，但在食管鳞癌中RUNX3基因启动子甲基化及其转录表达状况国内外尚无文献报道。从比较基因组学研究来看，食管鳞癌存在1p36.1位点的高频率杂合性缺失（LOH），由于RUNX3基因正好位于1p36.1位点，因此食管鳞癌的发生发展很可能涉及到RUNX3基因的表达改变。为此，我们第一部分运用半定量RT-PCR、Western blotting方法分别从mRNA及蛋白水平检测RUNX3基因在食管鳞癌中表达情况，并分析其与临床病理参数的关系，评判RUNX3基因是否是食管鳞癌的候选抑癌基因；第二部分首先运用MSP技术从DNA水平检测RUNX3基因启动子甲基化状况，探讨RUNX3基因在食管鳞癌中表达失活的可能机制；然后采用甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-azaC）对食管鳞癌Eca109细胞株进行干预，探讨5-azaC对Eca109细胞株生长增殖及其RUNX3基因表达的影响，以期进一步探讨食管鳞癌中RUNX3基因表达失活的机制并寻找肿瘤治疗的新靶点。第一部分食管鳞癌中RUNX3基因表达失活及临床意义的研究目的：探讨RUNX3在食管鳞癌中的表达情况及其与临床病理参数的关系，评判RUNX3基因是否是食管鳞癌的候选抑癌基因。方法：采用半定量RT-PCR、Western blotting方法分别从mRNA及蛋白水平检测RUNX3基因在Eca109细胞株、42例食管鳞癌组织及癌旁正常组织中表达的差异、并分析其与临床病理参数的关系等。结果：RT-PCR显示RUNX3 mRNA在Eca109细胞株中表达缺失，在54.8％（23／42）的食管鳞癌组织中表达缺失或明显下调，而在42例癌旁正常组织中正常表达，RUNX3 mRNA在癌组织与癌旁正常组织中的转录表达存在显著统计学差异（P＜0.001）。RUNX3 mRNA的表达缺失或下调与食管鳞癌淋巴结转移、TNM分期密切相关（p值均小于0.05），与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、饮酒史、家族史等之间无明显相关（P＞0.05）。Western blotting显示Eca109细胞株及47.6％（20／42）食管鳞癌组织RUNX3蛋白表达明显下调或缺失，而在癌旁正常组织中表达正常，RUNX3蛋白在癌组织与癌旁正常组织中的表达有显著统计学差异（P＜0.001），RUNX3蛋白的表达下调或缺失与淋巴结转移、TNM分期显著相关（P值均小于0.05），与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、饮酒史、家族史等之间无明显相关（P＞0.05）。结论：RUNX3基因在食管鳞癌组织及细胞株Eca109中存在明显的表达缺失或下调，并与食管鳞癌TNM分期及淋巴结转移密切相关，RUNX3是食管鳞癌的新型候选抑癌基因。第二部分食管鳞癌中RUNX3基因启动子高甲基化及其去甲基化干预研究第一节食管鳞癌中RUNX3基因启动子高甲基化及临床意义的研究目的：检测RUNX3基因启动子甲基化状况，探讨RUNX3基因在食管鳞癌中表达失活的可能机制。方法：采用MSP技术检测42例食管鳞癌、癌旁正常组织及细胞株Eca109中RUNX3基因启动子区甲基化状况，并分析其与临床病理参数之间的关系。结果：MSP表明64.3％（27／42）的食管鳞癌组织及Eca109细胞株中存在RUNX3启动子区高甲基化，而相应癌旁正常组织未见高甲基化，RUNX3启动子甲基化率在癌及癌旁正常组织比较中有显著统计学差异（P＜0.001），RUNX3启动子高甲基化与淋巴结转移、TNM分期密切相关（P值分别小于0.05和0.01）。无淋巴结转移（N0）组RUNX3启动子甲基化率为43.8％，而淋巴结转移（N1）组为76.9％，二者相比有显著统计学差异性（P=0.029）。食管鳞癌TNM分期早期（Ⅰ～Ⅱ期）RUNX3启动子甲基化率为38.9％，晚期（Ⅲ～Ⅳ期）为83.3％，二者相比有显著统计学差异（P=0.008）。27例RUNX3基因启动子高甲基化食管鳞癌组织中有23例其mRNA表达缺失或降低，20例RUNX3蛋白表达下调，RUNX3启动子高甲基化与mRNA及蛋白表达呈显著负相关（r=-0.82和-0.711，P＜0.001）。结论：RUNX3基因启动子高甲基化是RUNX3表达失活的主要原因，在食管鳞癌的发生发展中起重要作用，RUNX3基因启动子甲基化检测可作为食管鳞癌预后评估的肿瘤标志物。第二节5-氮杂胞苷对Eca109细胞株生长增殖及其RUNX3基因表达影响的研究目的：探讨5-azaC干预对Eca109细胞株生长增殖及其抑癌基因RUNX3表达的影响，以期进一步探讨食管鳞癌中RUNX3基因表达失活的机制并寻找肿瘤治疗的新靶点。方法：应用MTT法来观察5-azaC对Eca109细胞生长增殖的抑制能力，摸索有效细胞干预浓度；采用10μmol／L，20μmol／L，50μmol／L三种不同浓度的5-azaC处理Eca109细胞株，采用MSP检测干预前后Eca109细胞中RUNX3基因启动子区的甲基化状况；应用RT-PCR,Western blotting等方法检测干预前后Eca109细胞中RUNX3基因的mRNA和蛋白表达水平的变化；流式细胞仪检测干预前后细胞凋亡的变化。结果：Eca109细胞RUNX3基因启动子处于异常的高甲基化状态，经5-azaC处理后，高甲基化的RUNX3基因启动子部分去甲基化；处理前启动子高甲基化的RUNX3基因其mRNA或蛋白均不表达，去甲基化处理后能重新激活该基因表达，并呈一定的量效依赖关系；经三种不同浓度5-azaC处理后，Eca109细胞生长增殖减慢，凋亡率明显增加。结论：5-azaC能重新激活Eca109细胞中RUNX3基因mRNA的转录和增强蛋白表达，在一定范围内呈量效依赖关系，并能抑制细胞生长增殖，诱导细胞凋亡。