论文部分内容阅读
目的：研究探讨肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha TNF-α)基因单核苷酸多态性和血清中TNF-α水平与退变性腰椎侧凸(Degenerativelumbar scoliosis DLS)的相关性，从基因及分子水平研究退变性腰椎侧凸的病因，为临床分析退变性腰椎侧凸的病因及预防提供依据。退变性腰椎侧凸是指在骨骼发育成熟以后，在腰椎退变的基础上发生的脊柱畸形，一般冠状位Cobb角大于10度，但不超过40度，多发生在50岁以上的中老年人。退变性腰椎侧凸是一种立体的、复杂的旋转畸形，随着研究的进展，如生物力学，脊柱解剖的进一步认识，逐步发现退变性腰椎侧凸不仅存在冠状位上椎体的失平衡，还存在矢状位上的椎体平衡的丢失和旋转，多种畸形作用的结果导致腰背疼痛及下肢的神经症状。目前，我国逐步进入老龄化社会，该病发病率逐年升高，是影响老年人的生活质量的重要疾病。该病的发病原因复杂，具体机制尚不清楚，有研究证实了TNF-α与腰椎退变存在相关性，TNF-α通过激活炎性介质，介导炎性反应，引起腰椎退变，但在TNF-α基因水平及其血清中含量与退变性腰椎侧凸是否存在相关性，国内外很少有报道。本研究通过聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法（polymerase chain reaction restriction fragment polymorphisms assay，PCR-RFLP）及酶联免疫吸附测定方法（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）检测TNF-α基因启动子转录起始位点上游第308位点单核苷酸多态性及其血清含量，探讨此位点的多态性以及血清中TNF-α蛋白含量与北方汉族人群退变性腰椎侧凸的关系。方法：选取2009年10月至2011年12月于河北医科大学第三医院脊柱外科门诊及病房收治的60例退变性腰椎侧凸患者作为研究对象,均行腰椎正侧位X线及腰椎MRI检查，选取同时期于该院进行健康体检者60例作为正常对照组，两组研究对象均系无血缘关系的北方汉族个体，在性别、年龄、体重指数与病例组相匹配。收集两组患者的外周新鲜血液，用小量全血基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，应用聚合酶链反应（PCR）技术对两组研究对象DNA标本TNF-α基因启动子区特异性片段进行扩增，再应用限制性内切酶长度多态性（RFLP）技术对扩增的特异性片段用NcoI进行酶切，产物用2%琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测，分析其基因型及等位基因频率的分布。用酶联免疫吸附测定技术（ELISA），对两组研究对象血清TNF-a蛋白水平进行检测。利用Adobe Photoshop6.0软件，测量病例组MRI图像中顶椎间盘及其上下椎间盘内髓核与脑脊液T2加权像的相对信号强度，同时测量病例组正位X线片上的Cobb角。应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析，性别、体重指数、血清TNF-α含量比较采用t检验或方差分析。年龄、基因型及等位基因频率等计数资料比较采用χ2或Fisher精确概率法检验，血清TNF-α含量与椎间盘退变程度及Cobb角相关分析采用Linear correlate分析。结果：两组研究对象的年龄、性别、体重指数比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明在年龄、性别、体重指数方面匹配。TNF-α-308所在片段经PCR扩增后目的片段的长度为107bp，酶切后有3种基因型，G/G基因型(87bp、20bp2条带)，G/A基因型(107bp、87bp、20bp3条带)，A/A基因型(107bp1条带)。两组研究对象各基因型频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，研究对象具有代表性。TNF-α308多态性位点G/G、G/A和A/A基因型频率在病例组为分别为70.0%、26.7%和3.3%，对照组为86.7%、11.7%和1.7%，两组基因型频率差异无统计学意义(P＞0.05)。G/G基因型频率与非G/G基因型频率(G/A、A/A)及等位基因G、A频率在病例组为分别为70.0%、30.0%和83.3%、16.7%，对照组为86.7%、13.3%和92.5%、7.5%，两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。相对危险度比较提示，非G/G基因型比G/G基因型患病的危险性增大(OR=3.245，95%CI=1.240～8.495)，A等位基因携带者比非A等位基因携带者患病的危险性增加(OR=2.467，95%CI=1.074～5.667)。细胞因子TNF-α血清浓度，病例组163.25±3.44ng/L，对照组51.12±0.92ng/L，两组之间差异有统计学意义（P<0.05），且病例组显著高于对照组。TNF-α血清浓度与髓核相对信号强度呈负相关，与Cobb’s角呈正相关。将病例组根据椎间盘退变等级分组，各组之间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：北方汉族人群中TNF-α-308多态性与退变性腰椎侧凸无明显相关。退变性腰椎侧凸患者血清中TNF-α浓度比正常人群血清水平明显增高，血清中TNF-α浓度与侧凸角呈正相关，与退变性腰椎侧凸椎间盘髓核信号强度呈负相关，血清TNF-α浓度越高，椎间盘退变程度越重，TNF-α是退变性腰椎侧凸发生发展的危险因素。