脑卒中是我国疾病死亡并导致长期残疾的三大原因之一。脑梗死又是最常见的脑血管病。急性脑梗死后，因梗死灶中心神经细胞死亡而导致的神经功能缺损至今尚缺乏真正有效的治疗措施和药物。如何在有效时间窗内，拯救损伤灶周边半暗带区内濒死的神经细胞是目前国内外研究的重要课题。神经组织，尤其是胚胎神经干细胞移植被认为是可能有潜在应用价值的手段。但是，由于存在的伦理问题、免疫排斥问题，从而限制了其广泛应用。体外研究证明，骨髓基质细胞(marrow stromal cells, MSCs)可以不断分泌脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)等神经营养因子，这些营养因子是细胞存活、生长、分化的重要物质。研究还发现，应用外源性BDNF能够上调半暗带区神经元BDNF受体TrkB表达，防止神经元的死亡，减少梗死体积。因此，有必要弄清移植到脑内的MSCs是否通过产生BDNF等神经营养因子，从而发挥对“缺血再灌注”神经元的保护作用。本课题从骨髓基质细胞与“缺血再灌注”神经元的相互关系入手，着重从细胞和分子水平研究MSCs对“缺血再灌注”神经元的保护作用及其机理；并通过MSCs移植，进一步探讨MSCs移植治疗局灶性脑缺血的效果，移植到脑内的MSCs产生BDNF的情况，以及细胞凋亡、微血管密度的变化，从而为MSCs移植治疗局灶性脑缺血提供理论及实验依据。 第一部分 “缺血再灌注”损伤的海马片诱导骨髓基质细胞表达脑源性神经营养因子 取成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠骨髓，培养、分离、增殖、纯化骨髓基质细胞。以第4-6代的骨髓基质细胞进行有关实验。分离、解剖新生SD大鼠海马，经切片后培养。取培养第9d、生长良好的海马脑片，经缺糖、缺氧30min后复糖、复氧模拟“缺血再灌注”。设①对照组、②缺血联合组及③正常联合组。各组分别培养1、3、7d，每组、每个时间点各重复6次。利用免疫细胞化学及Western blot法检测不同条件下培养1、3、7d后骨髓基质细胞表达BDNF的动态变化。 研究结果显示：(1)BDNF免疫细胞化学染色发现，对照组MSCs内有微弱的BDNF表达。BDNF在缺血联合组MSCs胞浆内的表达随联合培养时间的延长而增强；复旦大李博士击文摘要联合培养后各个时间点BDNF表达明显高于对照组(第1、3、7d，p值均小于0.01)，亦显著高于正常联合组(第1、3、7d，p值分别小于0.05、0.05、0.01)。在培养第ld，正常联合组BDNF的表达与对照组相比无显著差异;但在第3、7d，BDNF的表达则有显著升高(p值分别小于0.05、0.01)。(2) Westem blot结果显示，对照组、缺血联合组及正常联合组MSCs均有BDNF的表达。对照组BDNF表达量最低。培养1、3、7d，缺血联合组BDN下的表达较对照组均有显著升高(尸值小于0.001)，亦显著高于正常联合组(第l、3、7d，尸值分别小于0.05、0.001、0.001)。正常联合组MSCs出现较低水平的BDNF表达，但联合培养第3、7d与对照组相比亦有显著升高(P值分别小于。.01、0.001)。第二部分骨髓基质细胞对“缺血再灌注”海马片的保护作用 取成年雄性sPrague一Dawley(sD)大鼠骨髓，培养、分离、增殖、纯化骨髓基质细胞。以第4一6代的骨髓基质细胞进行有关实验。分离、解剖新生SD大鼠海马，经切片后培养。取培养第gd、生长良好的海马脑片，经缺糖、缺氧30min后复糖、复氧模拟“缺血再灌注”。设①缺血组;②联合培养组;③抗BDN下抗体组。各组分别培养1、3、7d，每组、每个时间点各12张脑片。用相差显微镜及Leica Q500Iw图像处理系统对海马片神经轴突进行形态学观察并测量神经轴突分布面积、用透射电镜观察海马神经元超微结构变化、用碘化丙睫荧光排斥法检测神经元死亡情况。 研究结果显示:(l)“缺血再灌注”后，海马片神经轴突生长较慢、分布稀疏、覆盖面积较少。联合培养组培养1、3、7d海马片神经轴突密集，覆盖面积增加，与缺血组相比有显著性差异(p值分别小于0.05、0.001、0.001):联合培养3、7d，神经轴突覆盖面积亦显著高于抗BDN下抗体组(p值分别小于0.01、0.001)。抗BDNrF抗体组海马片神经轴突分布面积仅在培养第7d高于缺血组(p值小于0.01)。(2)“再灌注”后，尤其是在第3、7d，可见缺血组海马CAI、CAZ、CA3区及齿状回大片细胞死亡，密度以CAI区最高。联合培养组各时间点，死亡细胞均显著少于缺血组(p值小于0.001);联合培养1、3、7d海马片死亡细胞亦明显少于抗BD哪抗体组，值分别小于0.01、0.001、0.001)。培养第3、7d，抗BDN下抗体组海马片死亡细胞明显少于同时间点缺血组(p值小于0.05)。(3)“缺血再灌注”3d，缺血组海马片神经元超微结构破坏严重，细胞膜破裂，核皱缩，染色质凝集聚边，胞浆内大量空泡及溶酶体形成，细胞器破坏，神经轴突消失。联合培养组海马片绝大多数神经元细胞膜、细胞核及细胞器结构基本正常，可见神经轴突存在。抗BDN下抗体组海马片神经元形态不完整，胞浆内大量空足旦大李博士论文.要泡及溶酶体形成;但部分细胞器保存，核边缘光滑，染色质均匀，轴突破坏较严重。第三部分骨髓基质细胞静脉注射移植治疗大鼠短暂