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本文主要研究了贪噬菌Variovorax boronicumulans Jl降解烟碱类杀虫剂噻虫啉(THI)的机制,克隆了V.boronicumulans J1的腈水合酶基因及其激活蛋白基因,并在Escherichia coli BL21(DE3)中表达了具有THI水解活性的腈水合酶。本实验室前期研究发现贪噬菌V.boronicumulans J1可降解THI,液相色谱和质谱联用分析显示,转化产物的分子量为271(M+H2O),与酰胺-噻虫啉(THI amide)的分子量一致,表明J1菌株可以作用于THI的氰基基团使其转化为酰胺基,与腈水合酶的作用方式一致。本文进一步研究了在该过程中其关键作用的腈水合酶,利用兼并引物、反向PCR等方法从V.boronicumulans J1基因组上克隆出2.6Kb长的DNA序列,它包含完整的腈水合酶基因及其下游的激活蛋白基因。其中腈水合酶基因全长1304bp,包括长642bp的α亚基和长666bp的p亚基；激活蛋白基因全长378bp。对腈水合酶基因的核酸序列进行生物信息学分析,确定该腈水合酶为钴离子型腈水合酶。将腈水合酶基因和激活蛋白基因一起或单独与表达载体PET-28a连接并导入宿主菌E.coli BL21进行异源表达。SDS-PAGE和Western Blot检测到目的蛋白的表达。过表达菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-NHase和E.coli BL21(DE3)-pET28a-NHJ的静息细胞均可转化THI,且后者显示比前者有更高的腈水合酶活性；而不含腈水合酶基因的空质粒E.coli BL21(DE3)-pET28a则不能将转化THI。转化液经HPLC分析显示,产物的保留时间和THI amide相同；质谱分析显示转化产物与THI amide的分子量相同；核磁共振分析表明该产物与THI amide的碳谱和氢谱数据相同。上述结果表明,V.boronicumulans J1菌株的腈水合酶是将THI水解为THI amide的关键酶,其下游的激活蛋白基因编码对腈水合酶有活化功能的激活蛋白。腈水合酶底物特异性研究表明,含表达蛋白腈水合酶的E.coli BL21(DE3)菌株还可将3-氰基吡啶转化为烟酰胺。相关V.boronicumulans J1代谢THI及其腈水合酶的研究目前尚未见有报道,本文首次开展了V.boronicumulans J1腈水合酶的研究,对于微生物代谢和降解THI及其它腈类化合物具有重要的价值。