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目的：
为了了解动物粪便来源的肠杆菌科细菌对氟苯尼考的耐药性以及耐药基因的分布情况，探究氟苯尼考抗性与耐药基因之间的联系，进一步发现可能存在的新的氟苯尼考抗性机制。本文选取一株氟苯尼考耐药的非脱羧勒克菌R25进行氟苯尼考抗性基因文库的构建和全基因组测序分析，探究非脱羧勒克菌R25菌株对氟苯尼考耐药的分子机制。
方法：
1.2014年7月-2015年11月期间，用棉签拭子采集浙江温州地区动物养殖场鸡、鸭、鹅、兔和牛5种动物肛门粪便标本，并立即带回实验室接种于不加药LB固体培养基，进行细菌的分离纯化，以及菌株的编号保存。
2.首先根据革兰染色、触酶、氧化酶、葡萄糖发酵以及硝酸盐还原生化反应筛选出所有肠杆菌科细菌，然后根据鉴别生化反应确定细菌相应的属。同时，提取细菌基因组为模板，通过16SrRNA序列的测定鉴定细菌的种属。
3.以CLSI推荐的琼脂稀释法进行肠杆菌科细菌对氟苯尼考和氯霉素的药物敏感性实验，分析肠杆菌科细菌对氟苯尼考和氯霉素的耐药情况。
4.Primer5.0软件设计氟苯尼考耐药基因floR、cfr、pexA、fexA、fexB、optrA和estDL136引物序列，采用PCR法对所有肠杆菌科细菌进行上述基因的筛查，了解氟苯尼考耐药基因的分布情况及其对细菌耐药性的影响。
5.选取非脱羧勒克菌R25菌株进行氟苯尼考抗性基因文库的构建，并对筛选出的具有氟苯尼考抗性的片段进行测序分析和ORF预测。将预测出的含相应启动子序列的单个ORF分别克隆至pUCP24载体，通过琼脂稀释法确定其中具有氟苯尼考抗性的目的基因。
6.提取非脱羧勒克菌R25基因组进行全基因组测序，使用相应的生物信息学软件对测序结果进行拼接、注释。
7.非脱羧勒克菌R25耐药基因aac(6)-Ib-cr、arr-3、aadA16、floR和qnrB6及相应启动子区域的T-A克隆以及琼脂稀释法测定耐药基因的功能。
8.滤膜法接合转移实验检测非脱羧勒克菌R25中携带floR基因质粒的水平转移能力。
9.分别对非脱羧勒克菌R25中floR和ramA基因进行敲除，通过观察敲除前后R25菌株对氟苯尼考药物敏感性水平的变化，分析floR和ramA基因在非脱羧勒克菌R25菌株中氟苯尼考抗性的功能。
10.非脱羧勒克菌R25中含floR基因的pLA-64质粒上编码耐药基因相关可移动遗传元件区域的比较基因组学分析。
结果：
1.总共分离得到292株肠杆菌科细菌，涉及11个菌属，包括埃希菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、耶尔森菌属、勒克氏菌属、泛菌属和克吕沃菌属，其中以埃希菌属细菌最多，共251株，占86.0%。
2.药敏结果显示分离得到的肠杆菌科细菌对氟苯尼考的耐药率为61.6%(180/292)，对氯霉素的耐药率为65.1%(190/292)，而对氟苯尼考和氯霉素敏感的细菌分别为35.6%(104/292)和32.9%(96/292)。
3.PCR筛查结果显示64.4%(188/292)的菌株携带floR基因，只有1.0%(3/292)的菌株cfr基因阳性。未检测到其它已知的氟苯尼考耐药基因pexA、fexA、fexB、optrA和estDL136。
4.在构建的非脱羧勒克菌R25基因组随机文库中，最终筛选到一个与氟苯尼考抗性相关的转录调控因子ramA基因，并且体外克隆实验证明其具有氟苯尼考抗性。
5.全基因组测序结果显示非脱羧勒克菌R25由一个大小约4.74Mb的染色体和三个大小分别为5kb，64kb和109kb的质粒组成。其中染色体上含有1个mdfA耐药基因，pLA-64质粒上含有包括floR基因在内的8个耐药基因。
6.体外克隆实验证明氨基糖苷类耐药基因aac(6)-Ib-cr和aadA16对阿米卡星、卡那霉素、链霉素和大观霉素有抗性(MIC值至少升高3个梯度)，喹诺酮耐药基因qnrB6对萘啶酸、诺氟沙星和环丙沙星有抗性(MIC值至少升高2个梯度)，利福平耐药基因arr-3和氟苯尼考耐药基因floR分别对利福平和氟苯尼考有抗性(MIC值分别升高4个和3个梯度)。
7.floR基因敲除后的非脱羧勒克菌R25对氟苯尼考的MIC值下降了7个梯度(MIC值从128μg/mL下降至1μg/mL)；ramA基因敲除后非脱羧勒克菌R25对氟苯尼考的MIC值仅下降了1个梯度(MIC值从128μg/mL下降至64μg/mL)。
8.非脱羧勒克菌R25的pLA-64质粒不能通过接合转移传递。质粒上的floR基因由转座子介导，aac(6)-Ib-cr-arr-3-dfrA27-aadA16-qacEΔ1-sul1由1型整合子携带，qnrB6也与转座子相关。在其他细菌的染色体和质粒上也可见到这些耐药性基因相关序列。
结论：
1.动物来源的肠杆菌科细菌对氟苯尼考具有一定的耐药性，且floR基因是导致耐药性的主要原因。这可能是floR基因相关的可移动遗传元件加速了floR基因在不同种属细菌的传递转移。
2.在非脱羧勒克菌R25菌株中，转录调控因子ramA基因与floR基因均参与了氟苯尼考抗性，但其中起主要作用的是floR基因。ramA基因可能由于其主要调控非特异性多药外排泵的表达，起到外排氟苯尼考的作用。
3.质粒pLA-64上含floR基因在内的其他耐药基因都与可移动遗传元件相关，并且在其他细菌的染色体和质粒上也可见到这些耐药相关的基因序列。说明耐药基因可通过水平转移的方式造成耐药性的播散。
为了了解动物粪便来源的肠杆菌科细菌对氟苯尼考的耐药性以及耐药基因的分布情况，探究氟苯尼考抗性与耐药基因之间的联系，进一步发现可能存在的新的氟苯尼考抗性机制。本文选取一株氟苯尼考耐药的非脱羧勒克菌R25进行氟苯尼考抗性基因文库的构建和全基因组测序分析，探究非脱羧勒克菌R25菌株对氟苯尼考耐药的分子机制。
方法：
1.2014年7月-2015年11月期间，用棉签拭子采集浙江温州地区动物养殖场鸡、鸭、鹅、兔和牛5种动物肛门粪便标本，并立即带回实验室接种于不加药LB固体培养基，进行细菌的分离纯化，以及菌株的编号保存。
2.首先根据革兰染色、触酶、氧化酶、葡萄糖发酵以及硝酸盐还原生化反应筛选出所有肠杆菌科细菌，然后根据鉴别生化反应确定细菌相应的属。同时，提取细菌基因组为模板，通过16SrRNA序列的测定鉴定细菌的种属。
3.以CLSI推荐的琼脂稀释法进行肠杆菌科细菌对氟苯尼考和氯霉素的药物敏感性实验，分析肠杆菌科细菌对氟苯尼考和氯霉素的耐药情况。
4.Primer5.0软件设计氟苯尼考耐药基因floR、cfr、pexA、fexA、fexB、optrA和estDL136引物序列，采用PCR法对所有肠杆菌科细菌进行上述基因的筛查，了解氟苯尼考耐药基因的分布情况及其对细菌耐药性的影响。
5.选取非脱羧勒克菌R25菌株进行氟苯尼考抗性基因文库的构建，并对筛选出的具有氟苯尼考抗性的片段进行测序分析和ORF预测。将预测出的含相应启动子序列的单个ORF分别克隆至pUCP24载体，通过琼脂稀释法确定其中具有氟苯尼考抗性的目的基因。
6.提取非脱羧勒克菌R25基因组进行全基因组测序，使用相应的生物信息学软件对测序结果进行拼接、注释。
7.非脱羧勒克菌R25耐药基因aac(6)-Ib-cr、arr-3、aadA16、floR和qnrB6及相应启动子区域的T-A克隆以及琼脂稀释法测定耐药基因的功能。
8.滤膜法接合转移实验检测非脱羧勒克菌R25中携带floR基因质粒的水平转移能力。
9.分别对非脱羧勒克菌R25中floR和ramA基因进行敲除，通过观察敲除前后R25菌株对氟苯尼考药物敏感性水平的变化，分析floR和ramA基因在非脱羧勒克菌R25菌株中氟苯尼考抗性的功能。
10.非脱羧勒克菌R25中含floR基因的pLA-64质粒上编码耐药基因相关可移动遗传元件区域的比较基因组学分析。
结果：
1.总共分离得到292株肠杆菌科细菌，涉及11个菌属，包括埃希菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、耶尔森菌属、勒克氏菌属、泛菌属和克吕沃菌属，其中以埃希菌属细菌最多，共251株，占86.0%。
2.药敏结果显示分离得到的肠杆菌科细菌对氟苯尼考的耐药率为61.6%(180/292)，对氯霉素的耐药率为65.1%(190/292)，而对氟苯尼考和氯霉素敏感的细菌分别为35.6%(104/292)和32.9%(96/292)。
3.PCR筛查结果显示64.4%(188/292)的菌株携带floR基因，只有1.0%(3/292)的菌株cfr基因阳性。未检测到其它已知的氟苯尼考耐药基因pexA、fexA、fexB、optrA和estDL136。
4.在构建的非脱羧勒克菌R25基因组随机文库中，最终筛选到一个与氟苯尼考抗性相关的转录调控因子ramA基因，并且体外克隆实验证明其具有氟苯尼考抗性。
5.全基因组测序结果显示非脱羧勒克菌R25由一个大小约4.74Mb的染色体和三个大小分别为5kb，64kb和109kb的质粒组成。其中染色体上含有1个mdfA耐药基因，pLA-64质粒上含有包括floR基因在内的8个耐药基因。
6.体外克隆实验证明氨基糖苷类耐药基因aac(6)-Ib-cr和aadA16对阿米卡星、卡那霉素、链霉素和大观霉素有抗性(MIC值至少升高3个梯度)，喹诺酮耐药基因qnrB6对萘啶酸、诺氟沙星和环丙沙星有抗性(MIC值至少升高2个梯度)，利福平耐药基因arr-3和氟苯尼考耐药基因floR分别对利福平和氟苯尼考有抗性(MIC值分别升高4个和3个梯度)。
7.floR基因敲除后的非脱羧勒克菌R25对氟苯尼考的MIC值下降了7个梯度(MIC值从128μg/mL下降至1μg/mL)；ramA基因敲除后非脱羧勒克菌R25对氟苯尼考的MIC值仅下降了1个梯度(MIC值从128μg/mL下降至64μg/mL)。
8.非脱羧勒克菌R25的pLA-64质粒不能通过接合转移传递。质粒上的floR基因由转座子介导，aac(6)-Ib-cr-arr-3-dfrA27-aadA16-qacEΔ1-sul1由1型整合子携带，qnrB6也与转座子相关。在其他细菌的染色体和质粒上也可见到这些耐药性基因相关序列。
结论：
1.动物来源的肠杆菌科细菌对氟苯尼考具有一定的耐药性，且floR基因是导致耐药性的主要原因。这可能是floR基因相关的可移动遗传元件加速了floR基因在不同种属细菌的传递转移。
2.在非脱羧勒克菌R25菌株中，转录调控因子ramA基因与floR基因均参与了氟苯尼考抗性，但其中起主要作用的是floR基因。ramA基因可能由于其主要调控非特异性多药外排泵的表达，起到外排氟苯尼考的作用。
3.质粒pLA-64上含floR基因在内的其他耐药基因都与可移动遗传元件相关，并且在其他细菌的染色体和质粒上也可见到这些耐药相关的基因序列。说明耐药基因可通过水平转移的方式造成耐药性的播散。