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蔗糖酶(EC3.2.1.26),将蔗糖水解成D—果糖和D—葡萄糖的β—D—果糖苷酶的一种,又称为转化酶(invertase)或蔗糖酶(sucrase)。除广泛分布于微生物、植物外,类似的活性也在动物的消化液中发现,从链孢霉提纯获得的酶除作用蔗糖外,还可作用具有β—呋喃果糖苷键的物质。在植物生长发育和代谢过程中,蔗糖酶分解蔗糖成己糖,为植物的成长和发育提供能源和碳源,是植物碳氮代谢中的关键。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用。随着世界工业化与现代化的生产,越来越多的生物大分子被应用到社会的各项生产中,蔗糖酶也在食品加工等产业显示出了强大的功效。
一串红又名爆仗红(Salvia splendens Ker—Gawl),唇形科(Labiatae),鼠尾草属(Salvia)。一串红花色鲜艳,花期较长,尤其晚秋花色更为艳丽,是“五一”“十一”用花的重要材料。它的全株均可入药,有凉血消肿功效,并且能吸收空气中一定浓度有毒气体,将氮氧化物转化为植物细胞的蛋白质,是人类美化城市、健康生活不可缺少的一部分。
随着生物科学的发展,植物经济价值飞速提升的同时,其药用价值,工业价值也越来也受到人们的关注。一串红就是其中一例。本研究一方面可以为一串红的相关研究提供一定的理论基础,另一方面也期望一串红的利用价值得到更大程度的开发,提高其经济价值。本文主要对一串红幼叶片蔗糖酶进行分离纯化、理化性质研究、酶促动力学性质研究、抑制剂以及功能基团的化学修饰研究和固定化等方面的研究。结果如下:
1.蔗糖酶的分离纯化。以一串红幼叶片为原材料通过组织捣碎、缓冲液抽提、超滤、DEAE—Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-300凝胶过滤层析等方法获得纯化的蔗糖酶,以SDS—PAGE检测其纯度。其纯化倍数为190.82倍,比活性为181.28U/mg,回收率为22.21%。
2.蔗糖酶的理化性质研究。研究表明:蔗糖酶全分子量为130KD,亚基分子量为65.01KD,表明蔗糖酶是由两个相同的亚基组成。酶促动力学研究表明,蔗糖酶的最适pH值在5.0左右,在pH4.5~5.5的范围内比较稳定,最适温度在55℃左右,温度高于65℃以上不稳定,米氏常数Km值为55.6mmol/L。
3.金属离子及相关试剂的影响。金属离子中对蔗糖酶的抑制能力较强的是Ba2+、Ag+、pb2+;Cu2+、Mn2+对一串红的蔗糖酶有激活作用。在实验的几种化学试剂中,双氧水的抑制作用最强,其次是EDTA,尿素和抗坏血酸对活性的影响不显著。
4.蔗糖酶的化学修饰。采用NBS、PMSF、IAc、TNBS、PCMB、DTT修饰剂在一定的条件下修饰蔗糖酶,表明:PMSF、NBS、PCMB显著地抑制酶的活力,而IAc、TNBS、DTT对酶的活力影响不大。
5.蔗糖酶的固定化。比较分别用聚乙烯醇(PVA),海藻酸钠(CA),明胶(Glutin),琼脂,Phenyl—Sepharose,DEAE—Sepharose,CM—Separose等载体,或吸附或包埋并结合交联法制备固定化蔗糖酶的结果,得到最佳的实验方案为:20%明胶载体与酶液按2:1比例混合后,在4℃冰箱中冷凝1h,然后放入浓度2%的CaCl2中固定1h,然后放入5%浓度的戊二醛中交联1个h。反应最佳条件为pH5.0,55℃。此方法得到的固定化蔗糖酶机械性好,在高pH,高温下都维持固态,操作稳定性与储存稳定性均增加明显。