籼稻广陆矮4全长cDNA文库构建和序列分析及水稻单条染色体DNA文库构建

来源 :中国科学院研究生院(上海生命科学研究院) | 被引量 : 3次 | 上传用户:coldbee
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籼稻是世界上栽培面积最大的水稻品种。在本论文中,我们通过采用高效的全长cDNA文库构建方法完成了10,081条籼稻广陆矮4号全长cDNA (NCGR-cDNAs)的克隆及全序列测定。籼稻与粳稻的转录组(KOME全长cDNAs)比较分析表明,10,081条广陆矮4号cDNA中,7,388条与粳稻日本晴的全长cDNA有同源匹配,2,693条与粳稻日本晴的全长cDNA无同源匹配。2,693条与粳稻日本晴的全长cDNA无同源匹配cDNA中,1,751条NCGR-cDNA与日本晴的基因组序列有同源匹配。表达分析表明,这部分cDNA在粳、籼稻中均表达,但是表达量不同。64条NCGR-cDNA与粳稻日本晴的基因组序列无同源匹配,但是与籼稻93-11的基因组有同源匹配,这些cDNA多数是在广陆矮4中特异表达。通过3个籼稻品种、5个粳稻品种的基因组PCR验证表明部分为籼稻特异的序列。余下的878条cDNA与日本晴及93-11的基因组序列均无同源匹配,其中部分cDNA通过Southern杂交证明它们来源于水稻。与KOME cDNA有同源匹配的7,388条NCGR-cDNA中,7,346条cDNA有预测的开放阅读框(ORF)。其中,2,487(33.8%)条NCGR-cDNA编码的蛋白与粳稻中cDNA编码的蛋白完全一致;1273 (17.3%)条NCGR-cDNA与KOME cDNA之间存在单碱基多态性(SNP);其余的3,586 (48.8%)条NCGR-cDNA与KOME cDNA之间,因为SNP、插入与缺失(Indels)以及非同源区序列(Non-homologue sequences,NHS)等的差异而导致编码的蛋白存在较大的差异。籼、粳稻中,5’UTR、3’UTR及ORF区均相同的全长cDNA仅占7.5%。籼、粳稻cDNA序列的差异可能贡献于两个栽培稻亚种之间表型的变化。我们将NCGR-cDNA在水稻基因组上进行定位,得到了7,573个转录单元(TU),其中540个TU中含有1,382个选择性剪切的cDNA;93个选择性剪切在籼、粳稻间保守。另外,我们还得到了32对反义cDNA对。籼稻广陆矮4号全长cDNA的数据库提供了栽培稻两个亚种转录组比较的平台,包括基因结构的比较以及基因功能的进一步鉴定;这些cDNA的分析不仅扩展了对水稻已有基因的认识,同时从籼稻中克隆了一批新的基因。为了构建水稻染色体特异的DNA文库,我们将激光微操作系统成功地应用于从水稻中期细胞中分离出单条染色体。采用激光光刀切割细胞壁,激光光镊捕获释放的单条染色体;然后,将单条染色体收集于2微米的玻璃毛细管中,通过adaptor PCR的方法构建染色体特异的DNA文库。我们通过4号染色体特异引物扩增的方式鉴定了4号染色体的DNA文库。我们的实验结果表明,激光光镊同样可以用于其他亚细胞结构的分离,并且分离的材料可以成功用于单分子的扩增及克隆。
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