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背景:肥胖对人体健康的影响,尤其是营养性肥胖影响人体生殖系统的问题随着人们生活水平的日益提高,越来越普遍,从而也成为了研究的热点。有研究表明,正常大鼠睾丸中存在自发的生殖细胞凋亡现象,且具有其明显的规律性。凋亡发生时,线粒体在细胞凋亡的过程中发挥重要的作用。线粒体膜通透性增加,膜电位降低,细胞内NOS生成增多,ATP酶活性降低,膜间蛋白Cytc释放到胞浆中,激活caspase-3等凋亡相关因子,引起凋亡的发生。本文主要以免疫学、分子生物学以及生物化学的实验方法,考察营养性肥胖大鼠睾丸生殖细胞凋亡发生的情况,以及Cytc和caspase-3的变化,初步探讨Cytc和caspase-3参与生殖细胞凋亡调控的机制。细胞凋亡早期,细胞内ROS、NO和NOS等活性氧类物质生成增加,导致细胞氧化损伤增加。其中,Cyt c、AIF、caspase-3等凋亡相关基因mRNA,以及蛋白表达都显示出明显规律性,并且与睾丸生殖细胞凋亡的规律相一致,这种现象为探讨线粒体参与营养性肥胖大鼠睾丸生殖细胞凋亡的机制提供了必要的实验依据。Cyt c在线粒体调控细胞凋亡通路中处在中心地位,它通过激活下游caspases家族,继而发生凋亡。caspases家族是细胞凋亡通路的重要执行者。在论文中,我们以PCR的方法检测大鼠睾丸中Cyt c、caspase-3基因mRNA表达的变化;以免疫组织化学检测Cyt c和caspase-3蛋白的表达变化;采用HE染色以及TUNEL方法对睾丸的组织病理学和细胞凋亡进行观察。目的:通过建立营养性肥胖大鼠模型,探讨线粒体参与营养性肥胖大鼠睾丸生殖细胞凋亡的机制。方法:健康雄性Wistar大鼠40只,按随机化原则分为两组,每组20只,正常wistar大鼠为对照组,对照组给予普通饲料喂养,高脂组用高脂、高热量饲料喂养建立营养性肥胖大鼠模型,10周末处死大鼠摘取睾丸。全自动生化分析仪(ACA)检测外周血总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C);PCR的方法检测大鼠睾丸中Cyt c、caspase-3基因mRNA表达的变化;以免疫组织化学检测Cyt c和caspase-3蛋白的表达变化;采用HE染色以及TUNEL方法对睾丸的组织病理学和细胞凋亡进行观察。结果:1.动物模型的建立:对照组给予普通饲料喂养,高脂组给予高脂、高热量饲料喂养喂养。10周后,高脂组较对照组大鼠体重增加均大于20%,符合营养性肥胖大鼠模型。高脂组TC、TG、HDL-C和LDL-C(5.17±0.17、1.18±0.09、1.76±0.11、5.08±0.18)对照组(1.38±0.12、0.39±0.05、0.97±0.07、0.75±0.06)与对照组比较,高脂组外周血TC,TG,LDL-C水平明显升高(p<0.01);2.大鼠睾丸组织病理观察:正常情况下,大鼠睾丸精原细胞核大,常染色质呈颗粒状,线粒体形状完整;精母细胞异染色质呈块状,线粒体形状完整;精子细胞核染色质致密而均匀,线粒体结构完整。HE染色发现,高脂组睾丸生精上皮破坏明显,各级生精细胞脱落,精子细胞和精母细胞间隙变大,连接消失,精母细胞发生坏死。3.大鼠睾丸组织中凋亡细胞情况:10周末,对照组大鼠睾丸组织仅见散在分布凋亡的生精细胞,高脂组生精细胞凋亡指数(37.17±2.74)较对照组(5.16±0.81)显著升高(P<0.01),凋亡细胞以精原细胞和精母细胞为主。4.大鼠睾丸组织中Cyt c和caspase-3蛋白表达情况:免疫组织化学结果显示:caspase-3蛋白表达阳性的精原细胞即明显增加,大鼠睾丸Cyt c蛋白表达阳性的精原细胞和精母细胞有增多趋势。高脂组Cyt c蛋白(162.53±8.77)表达较对照组(134.37±6.96)明显升高(P<0.01);高脂组caspase-3蛋白(155.83±6.62)表达较对照组(106.34±8.23)明显升高(P<0.01)。5.大鼠睾丸组织中Cyt c mRNA、caspase-3 mRNA表达情况:高脂组Cyt c mRNA(0.86±0.01)表达较对照组(0.49±0.02)明显升高(P<0.01);高脂组caspase-3 mRNA(0.95±0.04)表达较对照组(0.39±0.03)明显升高(P<0.01)。结论:1.营养性肥胖可以引起睾丸生殖细胞结构的变化以及凋亡。2.营养性肥胖出现睾丸生殖细胞大量凋亡,同时睾丸生殖细胞凋亡的出现和Cyt c和caspase-3表达的升高同步,提示了机体肥胖时通过Cyt c和caspase-3调控睾丸生殖细胞凋亡。