文昌鱼（Amphioxus）隶属于脊索动物门（Chordata）头索动物亚门（Cephalochordata）,在地球上已经生活了五亿年之久,素有“活化石”之称。文昌鱼被视为无脊椎动物向脊椎动物进化的过度类群,代表着脊椎动物的直接祖先。此外,文昌鱼的基因组大小只有400M,未经过脊椎动物两轮全基因组重复,没有复杂和功能冗余的基因家族,拥有脊索动物最基本的一套编码基因,是研究脊椎动物基因染色体进化、基因家族起源、器官类型进化的最好模型。因此以文昌鱼为对象开展基因组演化研究是极有意义的。目前文昌鱼的基因组已经发表有佛罗里达文昌鱼（Branchiostoma floridae）和白氏文昌鱼（Branchiostoma belcheri）的基因组,我国常见的日本文昌鱼（Branchiostoma.japonicum）基因组未见报道。由于文昌鱼的基因组杂合度高（三种文昌鱼的杂合度估计在3.2%至4.2%之间,为动物中杂合度最高）,导致这2个文昌鱼种的基因组组装质量不高。为了解决这一基因组的困难,我们使用了“Trio binning”这一基因组组装的策略进行高质量文昌鱼基因组的组装。首先我们利用了本研究室文昌鱼人工繁育的优势,对实验室养殖的佛罗里达文昌鱼、白氏文昌鱼、日本文昌鱼这三种文昌鱼分别分组进行人工体外受精实验,发现佛罗里达与白氏和日本文昌鱼均能产生正常的受精卵,并且个体能生长发育,而白氏和日本文昌鱼之间存在着生殖隔离,卵子无法正常受精。我们进一步分别对2种文昌鱼杂交体（佛罗里达X白氏、佛罗里达X日本）进行三代Pacbio和二代Illumina测序,由于不同种的文昌鱼之间的染色体序列存在显著的差异,因此,我们根据三种纯种的文昌鱼二代Illumina测序数据,将杂交体文昌鱼的Pacbio数据拆分出相对应的2套物种的数据,然后再进行组装。这样进行基因组的组装就克服了文昌鱼杂合度高的难题。最后通过基因组的Contig组装和Hi-C辅助组装,我们分别获得了佛罗里达、白氏、日本文昌鱼这三种文昌鱼染色体级别单倍体型基因组。相比于已发表的文昌鱼基因组短读长测序组装结果,基因组的scaffold N50长度提高了200多倍,极大的减少了因基因组中的重复序列而产生的组装错误。经由BUSCO软件的检测与评估,基因组的完整性超过了97%。白氏文昌鱼和日本文昌鱼染色体上的间隙数小于3个,佛罗里达文昌鱼约为6个,这足以和脊椎动物参考基因组相媲美,甚至比他们更少。同时,三种文昌鱼的基因组都组装出了端粒序列,并且我们通过荧光原位杂交实验（FISH）,验证了端粒序列存在。综上所述,此部分的工作内容是获得了极高质量的三种文昌鱼基因组,为使用文昌鱼的基因组进行生物信息学的分析奠定了基础。进一步,我们选取了6种脊椎动物的模式生物与三种文昌鱼一起进行了物种分化时间的预估,结果发现三种文昌鱼之间种间分化发生巨大的分歧。但是三种文昌鱼在外形上只有细微的差别,这种种间的分化我们推测是发生在基因组的染色体上。我们分析了三种文昌鱼种间的染色体的融合事件,发现白氏文昌鱼拥有20个基因连锁群,在日本文昌鱼的染色体上发生了两次融合,即4号连锁群和19号连锁群融合、13号连锁群和17号连锁群融合;在佛罗里达文昌鱼染色体上发生了一次融合,即16号连锁群和20号连锁群融合。由于白氏文昌鱼拥有的染色体数目最多,代表了文昌鱼的祖先形态,另外由于鸡在脊椎动物中,表现了出最低的染色体进化谱系特异性,以及最低的基因复制率,是脊椎动物染色体的代表。因此我们将白氏文昌鱼与鸡的基因组进行比对,通过脊索动物连锁基因群（chordate linkage group,CLG）进行脊索动物祖先的核型的重建工作,阐明了白氏文昌鱼的20条染色体中哪些染色体通过染色体融合形成了17个脊索动物连锁基因群。另一方面,我们将文昌鱼和人、小鼠、斑马鱼、鸡这些脊椎动物的代表模式物种进行了基因收缩和扩张分析,分析了文昌鱼中发生复制的基因在脊椎动物基因进化中的横向同源性（paralogs）,说明在文昌鱼虽然没有发生过基因组的2轮扩增,但是其基因组内部已经开始基因组的倍增,进化历程中出现的基因加倍现象以后持续发生在脊椎动物的基因组2轮基因组倍增中。我们还分析了文昌鱼基因组的染色体片段复制（Segmental duplication）比例,发现三种文昌鱼的染色体片段复制均高于人、小鼠、鸡和斑马鱼这四种脊椎动物。这些发生了染色体片段复制的基因的GO功能富集在G蛋白受体活性、络氨酸蛋白激酶活性和核酸结合功能这些GO功能条目上。最后,我们对脊椎动物进化上最保守的Hox基因家族进行了分析,通过序列比对,我们绘制了文昌鱼的Hox基因家族进化到脊椎动物Hox基因家族的演化历程。长期以来,性别一直是生命科学研究的热点之一,性别决定贯穿于整个脊索动物的演化史,在进化生物学家眼中“性别是进化生物学中的问题皇后”。性别决定的机制主要有2种类型,一种是环境因素决定型,另一种是遗传决定型。我们研究室在长期的文昌鱼饲养中,确定了文昌鱼的性别决定与环境无关。我们在组装得到的三种染色体级别文昌鱼基因组基础之上,对三种文昌鱼都各选取了30个雌雄个体,通过GWAS分析分别在佛罗里达文昌鱼的18号染色体上筛选出一段16Mb的区间富集雌性特异性的SNP,在日本文昌鱼的3号染色体上筛选出一段2Mb的区间富集雌性特异性的SNP,在白氏文昌鱼的3号染色体上筛选出一段3Mb的区间富集雌性特异性的SNP。进一步,我们通过对于三种文昌鱼的性别SNP位点进行了PCR扩增测序,证明文昌鱼的性别决定为ZW型。我们在此基础之上,将雌性佛罗里达文昌鱼（ZW）和雄性日本文昌鱼（ZZ）进行杂交配对,通过对于后代的雌性杂交体进行测序,成功拆分出佛罗里达文昌鱼的W染色体型。在文昌鱼的性腺发育研究方面,我们仔细记录了三种文昌鱼的性腺发育历程,并且采集了三种文昌鱼未成熟和成熟的精巢和卵巢组织进行了转录组测序。我们在解析了三种文昌鱼的性别连锁区之后,所关注的是三种文昌鱼的性别连锁的区域上有哪些基因存在,这些基因在三种文昌鱼之间是否有共性存在。我们从日本文昌鱼的性别连锁区中筛选到一个候选的基因,该基因在佛罗里达文昌鱼和白氏文昌鱼中都存在,但是没有在性别连锁区中,同时也没有在脊椎动物中存在同源基因。我们进一步分析了该基因在三种文昌鱼的性腺转录组数据的表达情况,令人兴奋的是,该基因特异性的在三种文昌鱼未成熟和成熟的精巢中高表达,在未成熟和成熟的卵巢中低表达,表现出精巢的组织特异性。我们最后通过RT-PCR和原位杂交也证明了这个基因在精巢特异性表达。我们在三种文昌鱼性别连锁区中,用10个已报道的脊椎动物性别决定基因进行同源序列的比对,发现它们都不存在于三种文昌鱼的性别连锁区中。同时,目前已发现的脊椎动物上游性别决定基因,例如Dmrt1基因、Amh基因和Rspo1基因,在三种文昌鱼的基因组中都没有同源序列。我们进一步在文昌鱼精巢和卵巢的转录组数据中分析了这10个基因的表达情况,发现只有Foxl2基因和Sf1基因具有性别偏向性,表现为Foxl2特异性在卵巢组织中,Sf1特异性在精巢组织中。这些结果共同表明了,文昌鱼和脊椎动物具有各自进化其性别决定的途径。综上所述,我们通过杂交体测序的方法获得了高质量的三种文昌鱼基因组,并且进行了文昌鱼种间染色体融合分析,以及与脊椎动物祖先形态的染色体演化分析,发现了文昌鱼虽然没有发生过基因组的2轮扩增,但是其基因组内部已经开始基因组的倍增,绘制了文昌鱼的Hox基因家族进化到脊椎动物Hox基因家族的演化历程。最后,证明了文昌鱼的性别决定类型是ZW型,筛选到了一个精巢特异性表达的基因,通过性别连锁区基因和脊椎动物性别相关基因的保守性分析,阐明了文昌鱼和脊椎动物具有各自进化其性别决定的途径。