1.背景：　　镉及其化合物是重要的工业毒物和环境污染物，具有较强的蓄积性，生物半衰期较长。被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物，可以诱发多种肿瘤，大量流行病学与实验室研究发现通过职业接触、吸烟和摄入受污染的食物（谷类、蔬菜）等途径镉暴露会引起肾、肝、肺、生殖系统、造血系统等疾病，甚至导致相关肿瘤的发生。镉致癌作用机制研究方面有学者提出了氧化应激、信号通路改变、细胞增殖与凋亡异常、金属硫蛋白缺乏、表观遗传学等假说，但这些遗传学假说还没有完全阐明镉的毒性机制。Smoothelin（SMTN）基因位于染色体22q12.3，只在完全分化的平滑肌组织中丰富表达。既往的研究主要是利用SMTN鉴别固有肌层和粘膜肌层，也有研究发现SMTN影响消化道、心血管等内脏收缩功能,但在环境化学物损伤机制国内外皆无报道。本研究拟在细胞、动物水平探讨SMTN基因作为镉毒作用新分子标志物的可能性。首先在镉恶性转化的人支气管上皮细胞（Human bronchial epithelial cell，16HBE）模型上用qPCR技术验证SMTN基因的差异表达，RNA干扰技术（siRNA）稳定沉默SMTN基因表达后检测细胞一般生物学性状的改变（形态、生长周期、细胞周期），且在SMTN基因稳定低表达细胞检测SMTN对细胞急性镉毒性的影响（细胞抑制率、细胞凋亡、DNA损伤）。进一步检测亚慢性镉染毒大鼠模型组织中SMTN基因表达情况，分析SMTN表达水平与镉暴露的关系，从动物水平探讨SMTN的功能。　　2.目的：　　2.1.在本课题组前期已经建立的的镉恶性转化16HBE细胞模型的基础上，对16HBE细胞进行生物信息学方法分析，发现16HBE细胞 mRNA表达谱出现了SMTN基因的差异化表达，通过进一步的研究，查找资料对该基因的位点、形态、大小及保守性等生物学特性进行分析。　　2.2.在氯化镉恶性转化不同阶段16HBE细胞中验证SMTN的差异表达；用氯化镉（不同时间、不同剂量）染毒16HBE细胞，观察SMTN mRNA表达变化，探讨SMTN基因在镉致细胞毒性急性损伤中的表达。　　2.3.采用RNA干扰技术稳定沉默SMTN的表达后，研究SMTN低表达对细胞形态、生长周期、细胞周期等一般生物学特性的影响，探讨SMTN基因在镉恶性转化毒性中的作用。用氯化镉（不同时间、不同剂量）染毒16HBE稳定SMTN沉默细胞株，观察细胞抑制率、细胞凋亡，DNA损伤，探讨SMTN基因在镉致细胞毒性损伤中的作用。　　2.4.在本课题组前期建立的亚慢性镉染毒动物模型，观察亚慢性染毒后组织（肺、心、肝、肾）中SMTN mRNA的表达规律，探讨SMTN在镉致动物损伤模型组织中的作用。　　3.方法：　　3.1.qPCR技术检测SMTN基因的表达　　运用qPCR实验方法检测本课题组前期建立的氯化镉恶性转化模型细胞系不同阶段细胞SMTN基因的表达水平，同时检测不同剂量（0、10、20、30、40μmol/L）、不同时间（0、12、24、48、72 h）氯化镉急性染毒后SMTN基因的表达水平。　　3.2.构建稳定SMTN缺陷细胞株并检测其一般生物学功能　　利用慢病毒载体介导的细胞转染技术，把SMTN的短发夹双链RNA(shRNA)载体导入16HBE细胞，并将pCDH空载体作为对照。用嘌呤霉素筛选后分别命名16HBE-shSMTN，16HBE-pCDH，用qRT-PCR验证SMTN基因缺陷细胞株mRNA的表达。并观察缺陷细胞的形态、细胞生长曲线和细胞周期等一般生物学特征。　　3.3.SMTN缺陷对镉致细胞急性损伤的影响　　在稳定SMTN缺陷细胞株上同时检测不同剂量（0、10、20、30、40μmol/L）、不同时间（0、12、24、48、72h）氯化镉染毒，检测细胞的抑制率、细胞凋亡率、DNA损伤。　　3.4.在课题组前期构建的亚慢性镉染毒大鼠模型中研究SMTN的表达　　使用SPF级别SD大鼠，共四个剂量组：0.9％NaCl（对照组），0.306mg/kg（低剂量组），0.612mg/kg（中剂量组）和1.225mg/kg（高剂量组）；腹腔注射，连续染毒14周，每周染毒5次，用采用qRT-PCR技术检测大鼠体内主要脏器（肺、心、肝和肾脏组织）中SMTN表达情况。　　3.5.统计学方法　　所得实验结果运用统计学软件SPSS13.0进行统计学分析。MTT、qRT-PCR、细胞凋亡、细胞计数等每个样本3个平行，实验重复3次，SMTN基因mRNA的相对含量、细胞抑制率、凋亡率等均以mean±SD表示。三组及以上组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法或Dunnett T3法；以а=0.05作为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。彗星实验结果分析采取TriTek CometScoreTM彗星评分软件来测量各组彗星尾长(tail length,TL)、尾距（tail moment）、Olive尾距(Olive tail moment,OTM)、尾部DNA含量(Tail DNA%)。数据整理后录入统计分析软件SPSS13.0进行分析，以P＜0.05为显著性检验标准。　　4.结果：　　4.1.恶性转化过程中SMTN表达变化　　qRT-PCR检测结果显示，镉致16HBE细胞恶性转化细胞系中SMTN在恶性转化前细胞（14th）和恶性转化细胞（35th）中呈现上调表达，与未染毒对照组相比，14th和35th分别增加0.91倍和3.26倍，差异有统计学意义（P＜0.05），结果表明SMTN在细胞恶性转化过程中表达升高，且与恶性转化程度密切相关。　　4.2.SMTN基因在镉致16HBE急性损伤中的表达　　分别用10、20、30、40μmol/L CdCl2处理16HBE细胞24 h，利用qRT-PCR法检测细胞SMTN基因表达，20、30、40μmol/L处理组细胞SMTN mRNA相对表达分别2.943±0.212，10.602±1.334，3.782±4.571，与CdCl2未处理对照组比较有显著性差异（P＜0.01），且随着CdCl2染毒剂量的上升，SMTN mRNA表达逐渐升高。　　4.3.SMTN缺陷对细胞一般生物学性状的影响　　利用慢病毒载体介导的细胞转染技术，成功构建SMTN缺陷细胞株16HBE-shSMTN细胞，SMTN缺陷对细胞生长周期、形态结构、细胞增值率和细胞周期没有明显影响。　　4.4.SMTN低表达对镉致细胞急性损伤的影响　　4.4.1.SMTN低表达对镉致细胞凋亡的影响与对照组相比（16HBE），镉致SMTN缺陷细胞株在细胞生长抑制率无明显差异。利用Annexin V-FITC/PI双染法在流式细胞仪上检测16HBE细胞急性染毒模型细胞凋亡。结果显示，在10和20μmol/L CdCl2处理条件下，16HBE-shSMTN细胞细胞凋亡率分别下降11.9%、17.7%，差异具有显著性（P＜0.05），表明在一定剂量范围内（低于LD50）低表达SMTN可以抑制细胞凋亡。　　4.4.2.SMTN低表达对镉致细胞DNA损伤的影响利用单细胞凝胶电泳实验（彗星实验），与同组16HBE细胞相比，10、20、30μmol/L CdCl2处理16HBE-shSMTN细胞TL、TD（%）、TM和OTM值均显著性升高（P＜0.05）。不同时间梯度镉处理细胞，20μmol/L镉染毒16HBE-shSMTN细胞TL、TD（%）、TM和OTM值指标均高于相同处理的16HBE细胞与16HBE-pCDH细胞（P＜0.05）。表明低表达SMTN可以加重CdCl2所致的DNA损伤。　　4.5.大鼠模型组织中SMTN的表达规律　　在亚慢性镉染毒大鼠模型肺、心、肝、肾各组织中 SMTN均呈上调表达，肺组织各染毒组（低、中和高剂量组）SMTN的表达量分别为对照组的（3.2±0.43）倍、（8±1.02）倍和（5±0.63）倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；心脏组织各染毒组低、中和高剂量组SMTN的表达量分别为对照组的（2.5±0.33）倍、（1.6±0.22）倍及（3.7±0.54）倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；肝脏组织低、中、高染毒组分别为对照组的（1.8±0.23）倍、（6.96±0.82）倍和（4.0±0.64）倍，差异皆有统计学意义（P＜0.05）；肾脏组织低、中、高染毒组分别为未染毒对照组的（3.3±0.39）倍、（1.5±0.24）倍及（1.9±0.29）倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　5.结论：　　5.1.SMTN基因在氯化镉致16HBE恶性转化细胞模型中表达增加，并与恶性转化程度密切相关；在不同剂量、不同时间氯化镉急性染毒过程中，SMTN基因随着剂量的增加表达升高，存在明显的剂量反应关系。提示SMTN在镉致细胞急性损伤及细胞恶性转化过程中处于高表达的状态。　　5.2.SMTN缺陷对细胞生长周期、形态结构、细胞增值率和细胞周期没有明显影响，但在氯化镉中等剂量（10和20μmol/L）作用下，细胞凋亡降低，提示在镉致细胞急性损伤过程中 SMTN可能影响细胞凋亡。通过彗星实验可以发现在不同浓度梯度和时间梯度下处理，SMTN低表达组细胞组的损伤指标值明显上升， SMTN基因低表达状态下镉致细胞DNA损伤情况加重，提示SMTN基因可能参与镉致细胞急性DNA损伤作用过程。　　5.3.亚慢性镉染毒大鼠模型组织（肺、心、肝和肾脏）组织SMTN均呈上调表达，其表达水平与镉暴露水平呈不同程度的相关关系。　　从细胞、动物两个方面初步提示：SMTN在镉致细胞损伤早期即出现异常表达，且在恶性转化过程中保持高表达状态，可能通过影响细胞凋亡、DNA损伤从而参与细胞急性毒性损伤过程。这为 SMTN作为新的镉早期接触损伤检测标记物和镉毒性机制研究提供了新的策略。