本文围绕肿瘤抑制基因p53展开研究。论文分为两个部分：论文的第一部分的主要研究MDMX如何负调节RLIM对p53信号通路的激活作用。P53是一个关键的肿瘤抑制基因,超过50%的人肿瘤样本中p53基因有突变,在有野生型p53基因的肿瘤中,p53信号通路通常存在缺陷。MDMX与MDM2在结构上高度相似,它们都是p53重要的负调控蛋白。近期的研究发现,与MDM2相似,MDMX在多种肿瘤中存在基因扩增或者过量表达的现象,其中包括肝癌。MDMX的基因扩增或过量表达可能是使p53信号通路在肿瘤中失活的机制之一。在中国的肝癌患者的肿瘤中是否存在mdmx基因扩增的现象,目前还没有报道。我们在90例中国肝癌病人中检测了MDMX的mRNA水平,我们发现,与癌周正常组织相比,肿瘤中MDMX mRNA水平显著提高(Wilcoxon-signed rank test, p＜0.00001),提示MDMX在肝癌的发生或发展过程中发挥了一定作用。RLIM (RING finger LIM domain binding protein)是一个具有RING 112结构域的E3泛素连接酶,我们实验室的前期研究发现RLIM能够与p53和MDM2结合,并能促进p53的乙酰化并提高p53的转录活性。为了尝试去揭示MDMX上调表达在肝癌中可能发挥的作用,我们结合本实验室前期的研究结果,探讨了MDMX在RLIM对p53信号通路的调节过程中所扮演的角色。我们发现用siRNA干扰细胞内MDMX表达能够协同促进RLIM对p53信号通路的激活作用。MDMX和RLIM在细胞内或体外均能够相互结合。并且,我们鉴定了二者结合的结构域,发现MDMX的C端(aa304-490)与RLIM的两个结构域结合(aa209-226和aa313-410)。MDMX不能够调节RLIM的蛋白水平,但RLIM能够提高MDMX的蛋白水平,RLIM对MDMX蛋白水平的调节作用依赖于细胞内的MDM2。MDMX的mRNA水平不受RLIM影响,这说明MDMX只在蛋白水平受到了RLIM的调节。除此之外,MDMX能够被RLIM泛素化修饰。RLIM能够抑制MDM2对MDMX的降解,使MDMX的蛋白水平上升,这些结果说明MDMX的存在抑制了RLIM对p53通路的激活作用。进一步的研究发现,RLIM并不影响MDM2与MDMX的结合。我们用MDM2及RLIM的各种突变体设计竞争性免疫共沉淀实验,证明MDMX, MDM2, RLIM之间能够形成三联体结构。这种三联体结构的形成可能使得已被泛素化的MDMX不能顺利地被蛋白酶体识别并降解,进而抑制了RLIM对p53信号通路的激活作用。此外,论文的第二部分研究了MDM2, MDMX, Pirh2和COP1这四个p53负调控蛋白之间的相互作用。Pirh2和COP1是p53的E3泛素连接酶,可以不依赖于MDM2的作用泛素化并降解p53蛋白,也是p53的重要负调控蛋白。除了MDM2与MDMX之间的关系已有报道之外,MDM2或MDMX与Pirh2或COP1之间,以及Pirh2与COP1之间的关系还未见报道。我们发现,MDM2或MDMX与Pirh2或COP1之间,以及Pirh2与COP1之间能够结合,它们之间的结合不依赖于p53蛋白。在H11299细胞中,MDM2, MDMX, Pirh2和COP1之中的任意两个共同表达,会改变它们的蛋白的水平。其中,MDM2的环指结构域对其提高Pirh2和COP1的蛋白水平是必须的。而缺失环指结构域的COP1仍然能够提高MDM2, MDMX和Pirh2的蛋白水平。MDM2, MDMX, Pirh2,和COP1中任意两者共同表达能够协同抑制p53的转录活性。同时,COP1能够抑制MDM2的自身泛素化和MDM2对MDMX的泛素化。综上所诉,本文第一部分的研究发现MDMX在中国肝癌病人中上调表达,提示了MDMX在肝癌的发生或发展过程中可能发挥作用。同时,我们发现了一个新的能够调控MDMX的蛋白RLIMo MDMX, MDM2和RLIM三者能够形成三联复合体,这个三联复合体的形成能够抑制RLIM对p53信号通路的激活作用。我们的研究结果提示MDMX不仅能够直接抑制p53蛋白的活性,并且也能够通过间接的抑制RLIM对p53信号通路的激活作用来抑制p53的转录活性。论文第二部分揭示了肿瘤抑制基因p53的负调控蛋白MDM2, MDMX, Pirh2和COP1四者之间存在相互作用和影响,我们的结果提示,p53的负调控蛋白——MDM2, MDMX, Pirh2和COP1在体内特定条件下可能协同抑制p53的功能。