麦考酚酸对翼状胬肉成纤维细胞抑制作用的实验研究

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目的:研究麦考酚酸(MPA)对翼状胬肉组织成纤维细胞(PFB)活性的抑制作用,并对其相关机制进行探讨。方法:体外培养翼状胬肉成纤维细胞(PFB)及Tenon囊成纤维细胞(TFB),波形蛋白免疫组化染色法进行细胞鉴定,以丝裂霉素C(MMC)为对照,取第三代处于对数生长期的翼状胬肉与Tenon囊成纤维细胞,分别于接种后第二天、第四天、第六天行噻唑蓝[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]比色试验,检测细胞增殖活力(计数细胞数),以MTT比色法、5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)掺入法测定不同浓度的MPA分别作用48h、72h时,对体外培养的PFB增殖的抑制作用,并与MMC进行比较;4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色观察不同浓度的MPA作用72h后TPB形态学变化等;流式细胞仪检测不同浓度的MPA作用72h后体外培养的PFB和TFB凋亡及周期的变化;MTT法检测PFB和TFB抑制作用的异同,对其安全性做出初步评价。免疫组化染色法及Western blot法检测翼状胬肉成纤维细胞NF-KB通路中p65和IkB-a的表达情况。结果:翼状胬肉成纤维细胞较Tenon囊成纤维细胞生长增殖快、旺盛;培养至第三天,翼状胬肉成纤维细胞的细胞总数明显多于Tenon囊成纤维细胞(p<0.05),于接种后第四天最明显(p<0.01)。不同浓度的MPA作用72h对体外培养的PFB的增殖均有明显的抑制作用(p<0.01),本实验条件下MPA对PFB的IC50接近0.5umol/L,MMC IC50接近6umol/L。DAPI免疫荧光染色结果示各药物组与对照组相比,TFB细胞核形态无明显差异,未发现细胞凋亡小体及碎片,差异无统计学意义。流式细胞仪检测结果显示,MMC可引起TFB的凋亡或坏死,且随浓度的增加,凋亡率增大,而MPA各实验组凋亡率无明显变化,差异无统计学意义;MPA作用下,G0/G1期比例增多,S,G2/M期比例均减少,大多数细胞被阻滞于G0/G1期,浓度越高,作用越明显。免疫组化染色及Western blot结果示,MPA可以通过抑制IKB-α的磷酸化、P65的核易位,从而抑制NF-KB通路的激活,抑制免疫、炎症因子等的释放及炎症细胞浸润,最终抑制PFB的增殖。结论:MPA对PFB有显著的抑制作用,可能与其抑制PFB的NF-KB通路有关;不引起TFB的凋亡或坏死,毒副作用小,较安全。
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