D-乳酸是一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料，利用微生物代谢廉价底物，高效合成具有极高光学纯度和极高化学纯度的D-乳酸，是实现其工业应用的基本要素。大肠杆菌(Escherichia coli)可以作为D-乳酸合成的重要微生物，但野生型菌株进行D-乳酸发酵合成时，发酵液中副产物含量较高、乳酸转化率和合成速率低，必须通过有效代谢途径的改造或修饰，以提高D-乳酸发酵生产的化学纯度。此外，像其他的有机酸等发酵过程一样，乳酸发酵过程中也存在典型的细胞生长与产物形成间的代谢与控制矛盾，通过现代工业微生物育种理论与技术，解决这一发酵工业中具有普遍性的问题，以期D-乳酸发酵工艺过程的实施与过程控制更为顺畅和高效。本论文利用基因工程和代谢工程原理与技术，创新性地进行了野生大肠杆菌(CICIMB0013)乳酸合成相关竞争途径中酶基因的删除，并对乳酸合成速率进行精细调节和开关式控制使其与细胞活性相协调，获得了以较高细胞活性和高合成效率制造极高光学纯度和极高化学纯度D-乳酸的生产菌株，研究结果可经进一步工艺研究与放大后应用于D-乳酸的工业化制备。本研究获得主要结果如下：1.考察了10个乳酸合成竞争代谢途径中酶基因的删除对乳酸合成代谢的作用，构建获得D-乳酸产量高、副产物合成量低的重组大肠杆菌。在建立大肠杆菌多位点高效基因删除方法的基础上，将D-乳酸合成竞争途径：乙酸激酶(ackA)、磷酸转乙酰酶(pta)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)、FAD依赖型D-乳酸脱氢酶(dld)、丙酮酸氧化酶(poxB)、乙醇脱氢酶(adhE)、富马酸还原酶(frdA)、丙酸激酶(tdcD)、丙酮酸甲酸裂解酶4(tdcE)的编码基因在菌株B0013中进行组合删除，并考察这些代谢途径的单基因删除和组合删除在D-乳酸发酵中的作用。结果表明，ackA、pta、pflB、dld、poxB和frdA的单基因删除有助于提高大肠杆菌乳酸转化率和生产强度，而pps和adhE单基因删除不利于提高乳酸的转化率和生产强度。在删除ackA基础上逐步叠加删除pta、pflB、dld、tdcDE、adhE和frdA基因能够提高乳酸的转化率或降低副产物的合成量，删除pps和poxB基因对乳酸和副产物的合成无作用，而删除tdcDE基因可降低乙酸积累量但显著影响菌体的生长速率。在菌株B0013中，删除8个基因获得菌株B0013-070(ackA-pta pps pflB dld poxB adhE frdA)。该菌株的乳酸转化率和生产强度较B0013提高了1倍，副产物乙酸、琥珀酸、甲酸和乙醇的含量分别降低了95%、89%、100%和93%。菌株B0013-070在7L发酵罐中发酵产生125g/L D-乳酸，其光学纯度大于99.9%，化学纯度达到94.2%，发酵阶段乳酸转化率达96g/100g葡萄糖，生产强度达到0.61g/g·h，是出发菌株B0013的2.1倍；进一步在产酸阶段适度增加通气量，其乳酸合成速率提高为5.5g/L·h，化学纯度达到98.4%。2. ldhA基因上游区域部分缺失可实现乳酸合成速率的精细调节与细胞活性的协调。B0013-070在乳酸发酵过程中仍然有一定量的丙酮酸积累，预示由ldhA编码的D-乳酸脱氢酶催化丙酮酸到乳酸的合成蕴含精细调节的可能。为此，将具有不同长度上游区域的ldhA基因克隆于低拷贝重组载体，并转化菌株B0013-080C (B0013-070, ldhA)。所获得菌株的发酵罐发酵结果表明，ldhA结构基因上游区域长度由291bp缩短到106bp，可降低乳酸合成对重组菌株菌体生长的抑制程度，限氧阶段乳酸合成速率依次增加。ldhA基因-96位点下游的假定启动子可能具有转录启动或调节功能。而ldhA基因-61位点下游可能不具有转录起始区域。重组菌株B0013-080C/pTH-rrnB-ldhA8，具有72bp ldhA基因上游区域，菌体生长速率最快，且乳酸合成速率最高，达到11.7g/L·h，实现了乳酸合成与菌体生长的协调。3.对乳酸脱氢酶基因的转录进行开关设计与控制，构建了相应的重组菌，通过调控发酵培养条件可以高效、动态控制重组大肠杆菌乳酸的合成与菌体量的积累。乳酸发酵过程是一个典型的细胞生长与产物形成间的代谢与控制矛盾体，精确并简便调节这一矛盾体，可实现细胞的高速生长和乳酸的高效发酵生产。将菌株B0013-070染色体上的ldhA基因启动子(ldhAp)替换为λ噬菌体的pR-pL串联启动子，获得基于染色体水平开关控制的乳酸合成菌株B0013-070B (B0013-070, ldhAp::kan-cIts857-pR-pL)。新的重组菌的培养方式为：菌体生长阶段在33°C进行，经42°C、30min生长过渡后，转入发酵阶段。在此条件下，与菌株B0013-070好氧-限氧发酵结果相比，菌株B0013-070B好氧菌体转化率提高9%，发酵阶段体积生产强度提高了51%，D-乳酸比合成速率提高了46%，化学纯度提高到98.6%。