五味子多糖的提取纯化及其对肠道免疫功能的影响

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近年来,大量的研究表明五味子多糖具有多种生理保健功能,但是,五味子多糖对肠道免疫功能的影响尚不清楚。本研究以五味子干果为主要原料,采用超滤的方法制备了具有较高纯度的五味子精多糖,研究了五味子精多糖诱导肿瘤细胞凋亡,以及对小鼠肠道免疫调节的作用。主要研究结果如下:1.确定五味子精多糖的最佳制备工艺。五味子干粉脱脂后,于55℃热水中浸提2h;将提取液通过100Ku的超滤膜进行分离纯化,最佳的超滤压力是0.207Mpa,操作温度为20℃,超滤时间30min膜通量基本稳定;超滤液除去蛋白后经过巴氏灭菌和冻干后得到平均分子量为210ku的五味子精多糖。2.将制备的五味子精多糖溶于培养基使终浓度分别为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2mg/L作用于SMMC7721肝癌细胞,结果显示,在短时间处理(24~48h)时,五味子多糖对肝癌细胞没有显著的抑制生长作用(P>0.05),较高剂量在24h时甚至有一定促进增殖作用,在较长处理时间(72h)时,五味子多糖表现显著的肝癌细胞生长抑制和促进凋亡作用(P<0.05),其剂量大小与细胞存活率呈负相关。吖啶橙、溴化乙锭染色多糖作用肝癌细胞72h显示,空白组细胞几乎都呈绿色,形态完整,贴壁生长,多糖浓度0.05、0.5、2.0mg/L组别的橙黄色死亡细胞数量明显增加,细胞的形态和大小杂乱无章,贴壁生长的细胞边缘变得模糊不清,细胞发生凋亡现象,并与剂量呈正相关,进一步说明了五味子精多糖能够抑制SMMC7721肝癌细胞的生长。3.分别使用高(500mg/Kg d)、中(200mg/Kg d)、低剂量(50mg/Kg d)五味子多糖粉对BALB/c小鼠进行灌胃15天。小肠肠液中SIgA、小肠组织中各主要细胞因子含量经过前7天左右波动期后,基本处于稳定。在前七天免疫应答高峰期,IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10等细胞因子先后出现峰值,小鼠肠道黏膜免疫系统先后出现细胞免疫占主导地位、体液免疫占主导地位后免疫应答逐渐趋缓。10~15天长期灌胃结果显示:五味子精多糖可以促进肠道SIgA的分泌量,其SIgA的含量与剂量呈正相关。流式细胞仪对肠系膜淋巴结(MLN)的T淋巴细胞表型分析显示,高、中剂量组均能显著增大CD3+CD4+与CD3+CD8+比例,结合之前细胞因子和SIgA含量变化,推断高、中剂量的五味子多糖是依靠增加CD3+CD4+表型辅助性T细胞不同亚群细胞数量来增大该比例的,其中高剂量组可以增加Th2亚群的细胞数量和活性,中剂量组可以增加Th1、Th2亚群细胞活性和数量,低剂量组的CD3+CD4+与CD3+CD8+比例同对照组差异不显著(P>0.05),但可以增加Th1、Th2细胞的活性。4.中剂量(200mg/Kg d)、低剂量(50mg/Kg d)五味子多糖灌胃可以促进肠道黏膜免疫水平,同时提高体液免疫和细胞免疫能力,保持肠道免疫平衡,对抵抗外界异物感染、保证机体肠道健康最为有利;高剂量组(500mg/Kg d)可提高肠道体液免疫水平,但造成了肠道细胞免疫受到抑制,机体对外界异物不敏感,不利于机体肠道健康。
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