研究背景及目的原发性高血压(Essential Hypertension,EH)是多种心、脑血管事件的主要病因及危险因素,其影响心脏、大脑以及肾脏等重要脏器的结构和功能,最后导致这些重要器官的功能障碍,所以是心、脑血管等疾病死亡的重要原因之一。世界范围内高血压患者已超过10亿,因此高血压的防治是全世界所面临的重要课题。近年来,研究表明有规律的中、低强度有氧运动对降血压具有积极作用。研究发现对于药物不敏感的高血压,规律的有氧运动可以降低血压,因此,规律有氧运动是目前美国和欧洲高血压治疗指南中主要推荐的非药物治疗方式。其降压机制主要包括:运动训练可以调节大脑皮层及皮质下运动中枢,使其紧张度趋于正常,促使血压下降;调整激素分泌水平,使升高血压的激素分泌下降同时使降血压的激素分泌增加;增加一氧化氮的分泌,抑制内皮素的分泌;改善高血压机体慢性炎症及氧化应激状态;改善机体胰岛素抵抗等等。骨骼肌是机体重要的内分泌器官,运动过程中骨骼肌中1000种以上的基因被激活,激活相关转录因子从而促进白介素、肿瘤坏死因子α、瘦素、抵抗素、肌肉素和肌肉抵抗素等因子分泌,其内分泌功能紊乱与诸多疾病关系密切。鸢尾素(Irisin)是近年来发现的骨骼肌细胞分泌的含有112个氨基酸的多肽,运动过程中骨骼肌细胞中的转录因子PPARγ辅助活化因子1α(PGC-1α)表达上调,从而刺激含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5(FNDC5)基因表达增加,FNDC5胞外段即为irisin,后者脱落入血后发挥其生理作用。既往动物实验表明irisin可以减轻肥胖大鼠的体重和增加其胰岛素敏感性,临床研究发现II型糖尿病患者血浆中的irisin含量较正常人降低,irisin可以改善II型糖尿病小鼠血糖水平进而保护其血管内皮舒张功能。因为高血压与肥胖及II型糖尿病等代谢性疾病密切相关,故我们推测运动过程中骨骼肌产生的irisin也可能可以降低血压。既往研究发现大剂量irisin(0.1-100?M)能够舒张血管,但其降低血压的机制尚不完全明了,甚至有相互矛盾的报道。有报道irisin通过内皮依赖的途径舒张血管,并且单剂量注射irisin(0.625-4?g)既可以降低正常大鼠的血压又可以降低原发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)的血压;但是,另有报道irisin通过非内皮依赖途径舒张小鼠阻力血管。通过质谱仪分析结果,人体血浆中irisin的含量可以由静止时的3.6ng/ml上升到运动时的4.3ng/ml;Elisa方法测出大鼠血浆中irisin含量约为300-600ng/ml。所以,为了接近irisin在机体的生理效应,本实验拟用低浓度irisin观察其是否能够降低正常大鼠以及高血压大鼠的血压并明确其相关的血管机制。环一磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(5’-AMP-activated protein kinase,AMPK)即AMP依赖的丝氨酸和酪氨酸蛋白激酶,是参与细胞乃至整个机体代谢调节的关键分子。AMPK在所有真核细胞中均有表达,细胞中AMP/ATP比例的升高是其主要激活方式。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是调控血管舒张能力最主要的信号分子,血管中NO量的改变能快速改变血管张力从而调控血压。在血管组织中,AMPK能够直接刺激内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)磷酸化从而促进NO合成,进而舒张大动脉及阻力血管。既往研究也提出大剂量irisin(0.1-100?M)可以通过内皮依赖的NO-cGMP途经舒张血管。基于上述理论,本研究目的在于探究irisin是否能够通过激活AMPK-eNOS-NO途经改善SHR阻力血管内皮舒张功能从而降低其血压水平。研究方法第一部分:以成年WKY大鼠、SHRs为研究对象,明确急性给予irisin对血压及阻力血管舒缩功能的影响1.使用16-18周龄成年WKY(Wistar Kyoto Rat)大鼠及SHRs,急性给予大鼠浓度梯度的irisin(0.1,1,10?g/ml)以及煮沸后失去活性的相同浓度的irisin,用颈外静脉插管给药以及颈内动脉插管测血压方法监测其是否能够降低血压、以及血压开始降低的时间点、持续时间以及对心率是否有影响。2.目前对阻力血管(直径<200?m)张力的记录,国内外均采用小血管肌动描记仪进行精确测定。本实验在保证血管活性不受损的基础上,我们快速分离WKY及SHR大鼠肠系膜三级动脉,首先单剂量加入irisin(3000ng/mL)证实其是否具有直接舒张阻力血管的作用;在此基础上,在血管槽生理盐溶液(Physiological salt solution,PSS)液中加入不同浓度irisin(600ng/mL[48n M])或3000ng/m L([240nM],1hr)预孵育,观察其对血管舒张物质乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach,1-100nM)、硝普钠(Sodium nitroprusside,SNP,1-100nM)及血管收缩物质苯肾上腺素(Phenylephrine,PHE,1-10?M)的效应,从而检测其是否发挥间接调控阻力血管张力的作用。第二部分:以人原代冠状动脉内皮细胞、SHR大鼠及其肠系膜三级动脉为研究对象,探索NO是否是irisin调控血管张力进而降低血压的关键信号分子1.我们用两种方法测量NO:(1)NO探针标记人冠状动脉内皮细胞,实时测量内皮细胞内生成的NO;(2)测量内皮细胞上清硝酸盐化合物的含量间,接测量细胞中生成的NO。预先装载NO探针DAF-2DA后,用激光共聚焦显微镜观察:人原代冠状动脉内皮细胞中加入irisin(600ng/m L或3000ng/mL)是否能直接促进内皮细胞的NO生成或irisin(3000ng/mL)预孵育后对Ach(100nM)介导的NO生成是否具有促进作用,上述变化能否被e NOS抑制剂L-NAME(100?M)阻断。NO分子不稳定,在短时间内可以转化为硝酸盐和亚硝酸盐,人冠状动脉内皮细胞中加入irisin(3000ng/mL)刺激10min后,收集培养上清,然后通过试剂盒中Griess reagent检测亚硝酸盐,从而测出总NO含量;随后,加入NOS抑制剂L-NAME(100?M),观察其是否能阻断irisin诱导的NO生成。2.利用SHR肠系膜三级动脉以及人冠状动脉内皮细胞作为研究对象,不同时间(15min,30min,1hr,3hr,6hr)和浓度梯度(100,200,300,600ng/ml)地加入irisin,检测p-e NOS、eNOS含量是否增加,并观察p-nNOS、n NOS是否有变化,进一步确认irisin到底是通过刺激eNOS或nNOS,促使血管内皮细胞的NO生成;3.为了探索NO是否是irisin作用于血管张力进而降低血压的关键信号分子,在固定SHR肠系膜三级动脉的传感器浴槽中提前30min加入NOS抑制剂L-NAME(100?M)、环氧合酶抑制剂indomethacin(10?mol/L)及内皮依赖性超极化因子抑制剂KCl(60mM),观察这些药物是否能够阻断irisin促进Ach介导的舒张血管效应。在此结果的基础上,观察L-NAME(30mg/kg)单剂量注射是否能够阻断irisin的降血压效应。第三部分:以人冠状动脉内皮细胞及SHR肠系膜三级动脉为研究对象,明确AMPK-Akt-eNOS-NO信号通路是否参与irisin降低血管张力从而降低SHRs血压的过程人冠状动脉内皮细胞不同时间(15min、30min、1hr、3hr、6hr)和浓度梯度(100、200、300、600ng/ml)加入irisin,检测p-AMPK以及蛋白激酶B(Protein kinase B,p-Akt)含量是否增加;并且提前加入AMPK抑制剂Compound C(20?M,30min),观察p-Akt、p-e NOS的含量是否下降、是否能阻断irisin促进乙酰胆碱的舒张血管效应。研究结果第一部分:Irisin能够改善SHR肠系膜三级动脉血管内皮舒张功能从而降低血压1.急性颈外静脉给予irisin可以浓度依赖性地降低SHR的血压水平,但不能降低WKY大鼠的血压。给与SHR大鼠irisin(10?g/kg),5min后开始降压,10min后降压幅度明显增加,20min后达到最大幅度,90min后恢复到基线水平。我们发现煮沸后的irisin没有降压作用,故排除过敏反应所致的降压效应。此外,irisin的降压过程不伴有明显的心率变化。2.对苯肾上腺素预收缩的血管,irisin对WKY和SHR肠系膜三级动脉均没有明显的直接舒张作用;但irisin(3000ng/mL)预孵育1hr后,能够增加SHR肠系膜三级动脉对Ach的舒张反应、降低血管对PHE的收缩反应,但在WKY大鼠中没有观察到上述效应。Irisin对WKY和SHR肠系膜三级动脉中SNP介导的舒张反应均无明显促进效果。上述结果提示irisin通过内皮依赖的途径改善SHR大鼠阻力血管舒缩功能紊乱。第二部分:Irisin通过增加血管内皮一氧化氮生成量从而改善SHR肠系膜三级动脉内皮舒张功能1.通过提前标记人冠状动脉内皮细胞DAF-2 DA探针的方法,我们发现加入irisin可以浓度依赖性刺激内皮细胞生成NO,荧光强度在1min之内增强,4min左右达到最大水平,并且该作用能被NOS阻断剂L-NAME阻断。内皮细胞中加入irisin,10min后收集培养液,与对照组相比,irisin刺激后培养基中硝酸盐和亚硝酸盐含量增加,该作用能被NOS阻断剂L-NAME所阻断,说明irisin是通过激活NOS起作用的。并且,内皮细胞预孵育irisin(3000ng/ml,1hr)后,可以增加Ach促内皮细胞NO生成。2.分离SHR肠系膜三级动脉,予其不同浓度及时间的irisin刺激,我们发现irisin(600ng/ml)在15min内可以使e NOS-ser1177活化增强,1hr左右达到最大水平,6hr后降低到基础水平;给予不同浓度irisin刺激30min后,其能浓度依赖性地增加血管组织NO的生成。同样地,irisin刺激内皮细胞后也能浓度及时间依赖性地使内皮细胞e NOS-ser1177活化增强。在内皮细胞中,e NOS的表达最丰富;而且,我们还发现刺激60min后,irisin虽然也能使nNOS磷酸化水平增加,但强度没有eNOS磷酸化水平增强明显。3.在SHR大鼠肠系膜三级动脉组织中提前给予NOS阻断剂L-NAME、前列环素阻断剂吲朵美辛及内皮依赖性超极化因子(Endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF)阻断剂KCl(60mM)后,我们发现irisin促Ach舒张作用能被NOS阻断剂L-NAME所阻断,但不能被吲朵美辛以及KCl阻断。此外,我们还发现L-NAME(30mg/kg,单剂量注射)可以阻断irisin降血压作用。第三部分:irisin通过P-AMPK-Akt-e NOS途径促进血管内皮细胞NO的生成Irisin刺激人冠状动脉内皮细胞后,可以呈时间以及浓度依赖性增加p-AMPK、p-Akt的生成,但对总的AMPK及Akt含量无明显影响。增加的p-Akt以及p-eNOS均能被AMPK阻断剂Compound C(20?M)阻断。此外,在SHR大鼠肠系膜三级动脉组织中,Compound C可部分阻断irisin促Ach舒张作用。研究结论:通过本实验,我们发现irisin不能降低WKY大鼠的血压,但是可以浓度依赖性地降低SHR大鼠血压水平,该降压效应并非过敏反应所致。低浓度irisin(48 n M和240n M)不能直接舒张WKY大鼠和SHRs肠系膜三级动脉,但可以通过增加血管内皮细胞AMP/ATP的水平从而激活AMPK–Akt-eNOS-NO信号通路,促进Ach舒张功能及降低PHE收缩功能,改善SHR大鼠血管高张力状态,最终降低血压水平。该研究结果不仅为运动降压提供新的理论依据,也为高血压治疗的药物研究提供了一个新的方向。