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血友病A(HA)是一种先天性凝血因子VIII(FVIII)缺乏,以致凝血酶生成障碍的X染色体连锁隐性遗传性出血性疾病。临床上常用的替代疗法由于代价昂贵、极易产生抑制物限制了其应用,而基因治疗可能是解决这些问题并彻底治愈这项疾病的有效手段。FVIII靶向血小板表达的基因治疗策略是治疗产生抑制物抗体血友病A的理想途径,但病毒载体的使用有潜在的插入突变可能,此外较低的基因转导及表达效率也制约着临床应用的开展。为此我们拟探索通过基于诱导多能干细胞(iPSC)水平上的定点基因编辑(CRISPR/Cas9)技术克服上述瓶颈。iPS细胞具有无限的增殖潜能且能分化为包括造血干祖细胞(HSPCs)在内的多谱系细胞,其在多种遗传性疾病的基因治疗中发挥着巨大的作用。而CRISPR/Cas9介导的位点特异性整合能够高效的将目的基因靶向到预设位点从而消除插入突变的潜在危害性,故而iPS细胞水平上的基因编辑对于血小板靶向的基因治疗HA具有广泛的应用前景。为此,我们通过分离新生F8KO小鼠尾尖成纤维细胞(TTF)重编程获得HA-miPSC,而后将置于GPαIIb启动子控制下的密码子优化的BDD-FVIII定点整合到miPSC的mROSA26安全位点上,筛选获得定点整合的单克隆。因hHoxB4在多能干细胞诱导造血分化中的作用,我们在此基础上构建了hHoxB4介导的2bopF8-HAiPSC并通过畸胎瘤法体内诱导分化为HSPCs并移植入致死剂量辐照的HA小鼠。分析移植后其能够恢复造血重建并生成能够储存FVIII的血小板,同时基本不会影响血小板的正常功能,经剪尾生存实验可明显改善移植后小鼠的出血表型。此外我们同时将经CRISPR/Cas9定点整合的iPS细胞通过囊胚注射获得嵌合鼠,能参与其造血系统的发育,并可产生表达FVIII的血小板,且经过二次骨髓移植仍能够造血重建并发挥治疗功能,表明分化的造血干细胞具有完整的生物学功能。本课题研究结果提示:结合iPS诱导造血分化及靶向血小板的基因治疗策略可有效的矫正F8KO小鼠的出血表型,具有长期的治疗效果且不会诱导抑制物形成,值得进一步深入研究。