1研究背景恶性腹水（Malignant ascites,MA）亦称癌性腹水,是恶性肿瘤细胞侵犯腹膜引起的腹腔内液体异常增多,是多种恶性肿瘤晚期常见的严重并发症之一。恶性腹水的反复发生及其引起的难以忍受的腹胀、腹痛成为影响晚期恶性肿瘤患者生活质量的重要原因。有效的减少腹水,减轻症状,改善患者的生活质量成为棘手的问题。目前恶性腹水产生的机制尚未完全明确,治疗手段众多,收效多不理想。本课题所研究的实脾消水乳膏处方来源于中日友好医院中西医结合肿瘤内科,是治疗恶性腹水的临床经验方,方以“益气健脾,温阳利水,行气活血”为治则,经临床验证疗效确切。前期多中心临床研究显示,能够减少腹水量,改善腹胀、呼吸困难等症状,提高患者生活质量。实验研究亦表明,能够明显减少腹水量,促进肿瘤细胞凋亡。然而目前尚无研究深入探讨其在体内“多成分-多靶点-多途径”的药理作用机制。故本研究运用整体药效学、代谢组学等方法,探究实脾消水乳膏治疗恶性腹水的药效及可能的作用机制。2研究目的基于对临床经典方的传承,开发实脾消水处方乳膏剂型的新药研究。以实脾消水乳膏外治恶性腹水的药效评价、作用机理及代谢组学的系统性相关研究,为该制剂作为中药新药临床应用治疗恶性腹水的开发提供实验依据。3研究内容与方法3.1实脾消水乳膏外治恶性腹水的药效学评价应用H22肝癌小鼠腹水模型和艾氏腹水瘤小鼠（EAC）模型两种恶性腹水模型,采用低、中、高三种浓度实脾消水乳膏,测量小鼠腹围、体重,B超检测小鼠腹水量,观察尿量,观察实脾消水乳膏对小鼠体重、腹围、腹水量、尿量的影响,评价其药效。3.2实脾消水乳膏外治恶性腹水的机理研究应用H22肝癌腹水模型,通过生化分析方法检测小鼠尿液Na+、K+、Cl-离子的含量,ELISA检测血清中肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RASS）中肾素、Angll、抗利尿激素（AVP）、ALD,通过分析实脾消水乳膏对H22肝癌腹水模型尿液（Na+、K+、Cl-）、及血浆肾素-血管紧张素系统（RAS）Angll和抗利尿激素（AVP）的改善作用,免疫组化检测肾脏水通道蛋白1（AQP1）的表达,ELISA检测腹水中AQP1的表达,从水液调节的角度系统评价实脾消水乳膏发挥治疗恶性腹水功效的作用机制。应用H22肝癌腹水模型,比较各组小鼠各脏器重量,采用自动血细胞分析仪对小鼠外周血血象进行分析,测量恶性腹水中肿瘤细胞的数量,采用流式细胞术检测外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）数量,尾静脉注射依文思蓝染液检测腹膜通透性,ELISA检测血清细胞因子白介素-2（IL-2）、IL-10水平变化,ELISA检测腹水中细胞因子VEGF、MMP-2、IL-2、TNF-α、INF-γ、IL-6的表达量水平,从免疫调节的角度系统评价实脾消水乳膏发挥抗肿瘤、治疗恶性腹水功效的作用机制。3.3基于代谢组学的实脾消水乳膏外治恶性腹水的生物学效应研究采用基于UHPLC-QTOF-MS非靶标代谢组学技术研究方法,对小鼠尿液小分子内源性代谢物组分以正负离子模式扫描检测供试品,利用OPLS-DA（正交偏最小二乘法-判别分析）检测实脾消水乳膏对治疗恶性腹水小鼠尿液潜在生物标记物含量的影响,从代谢通路角度探讨实脾消水乳膏干预治疗恶性腹水的作用机理。4研究结果4.1实脾消水乳膏外治恶性腹水的药效学评价应用H22肝癌腹水模型与艾氏腹水瘤模型,结果均显示造模后模型组小鼠体重及腹围增长迅速,超声示腹腔大量积液,尿量减少,模型复制成功。与模型组小鼠相比,实脾消水乳膏中剂量、高剂量能够减缓小鼠体重及腹水增长趋势,减少腹水量,增加尿量,差异有统计学意义（P＜0.05）。未观察到低剂量实脾消水乳膏减少腹水效果。中剂量、高剂量实脾消水乳膏减少腹水量及增加尿量效果与利尿剂氢氯噻嗪相当。4.2实脾消水乳膏外治恶性腹水的机理研究与正常组相比,H22肝癌恶性腹水小鼠尿液中Na+、K+、Cl-离子浓度均升高,血清中PRA、Ang Ⅱ、ALD、ADH均升高,肾脏AQP1表达量增加。实脾消水乳膏能够降低小鼠尿液中Na+、K+、Cl-离子浓度含量（P＜0.05）,降低血清中PRA、Ang Ⅱ、ALD、ADH浓度（P＜0.05）,降低肾脏AQP1表达,氢氯噻嗪能够降低ALD、ADH浓度,降低肾脏AQP1表达量。对各组腹水上清中AQP1的表达量检测结果未见明显差异。对腹水中肿瘤细胞计数结果显示,各组腹水中肿瘤细胞总数与细胞存活率均未见显著差异,尾静脉注射依文思蓝染液检测腹膜通透性,未见明显差异。对腹水中VEGF含量检测发现,与模型组相比,氢氯噻嗪及实脾消水乳膏能降低腹水瘤小鼠腹水中VEGF的含量（P＜0.01）,对腹水中MMP-2表达量测定结果,未发现MMP-2在三组间表达差异。各组小鼠各脏器重量的比较,结果显示与正常小鼠相比,肝癌H22腹水瘤小鼠胸腺重量减轻明显（P＜0.01）,实脾消水乳膏组能够提高小鼠胸腺重量。检测各组小鼠的血象变化,结果示与正常组相比,H22肝癌腹水瘤小鼠红细胞降低（P＜0.05）,血红蛋白降低（P＜0.01）,白细胞升高,血小板升高（P＜0.05）,淋巴细胞百分比降低（P＜0.05）。实脾消水乳膏组能够提高血红蛋白,增加淋巴细胞百分比,差异有统计学意义（P＜0.05）。对血液中T细胞亚群的分析,结果表明与正常小鼠相比H22肝癌腹水瘤小鼠CD4+T淋巴细胞比例减少,CD8+T细胞比例增加,Treg细胞比例增加,差异有统计学意义。实脾消水乳膏能够增加CD4+T淋巴细胞比例（P＜0.05）,对CD8+T淋巴细胞及Treg细胞有下调的趋势,但未见显著性差异。H22肝癌腹水瘤小鼠血清IL-2表达较正常小鼠降低,IL-10含量明显高于正常组（P＜0.05）,实脾消水乳膏组可显著升高IL-2水平（P＜0.01）,差异有统计学意义。实脾消水乳膏可降低IL-10表达量,但差异无统计学意义。对恶性腹水中IL-2表达量进行测定,结果显示,与模型组相比,实脾消水乳膏能够增加腹水中IL-2的表达量（P＜0.05）。对TNF-α、INF-γ、IL-6等细胞因子表达量进行测定,未发现其在三组有差异。4.3实脾消水乳膏对恶性腹水小鼠模型代谢的调节作用恶性腹水模型小鼠尿液中10个内源性生物标记物主要通过以下途径作用:氨基酸代谢通路,能量代谢通路、核苷酸代谢（嘌呤代谢通路）。实脾消水乳膏组的小鼠尿液中的标记物基本含量都趋近于正常对照组的方向回调,与模型组相比,实脾消水乳膏组回调37个标记物,氢氯噻嗪组回调7个标记物。5结论实脾消水乳膏中剂量、高剂量能够减少H22肝癌腹水瘤小鼠和EAC腹水瘤小鼠的腹水量,以中剂量效果最佳,与利尿剂氢氯噻嗪效果相当。实脾消水乳膏可降低H22肝癌腹水瘤小鼠尿液中Na+、K+、Cl-离子含量,降低血清中PRA、Ang Ⅱ、ALD、ADH的浓度,减少肾脏AQP1的过表达,说明其通过调控RAAS系统发挥利尿功效,进而促进腹水的排出,减少腹水量,纠正电解质紊乱。实脾消水乳膏可增加小鼠的胸腺及脾脏重量,增加淋巴细胞百分比,增加CD4+T淋巴细胞比例,显著升高血清及腹水中IL-2水平,说明其是通过正向调节免疫作用发挥一定的抗肿瘤的作用,进而减慢腹水的生成。实脾消水乳膏对恶性腹水症状有一定缓解作用,实脾消水乳膏可改恶性腹水引起的代谢紊乱,可能是通过调节氨基酸代谢通路,能量代谢通路、核苷酸代谢等通路的代谢紊乱达到其治疗作用,可从代谢通路的角度揭示其治疗作用机理。