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研究背景超过80%的胰腺癌为胰腺导管细胞癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC),其预后极差。即使对于Ⅰ期-ⅡA期的较早期PDAC,其总体5年生存率也仅约为30%,故单纯手术切除对于PDAC是远远不够的。NCCN指南建议对任何分期的PDAC患者均应考虑化疗。吉西他滨(gemcitabine,GEM)是目前术后辅助化疗的一线用药,但其有效率也低于20%,故如何提高GEM的疗效是一个极其重要的临床问题。PDAC具有特殊的肿瘤免疫微环境(tumor immune micro-environment,TIME),表现为大量炎性细胞浸润,而癌细胞仅为10%-30%。研究表明以TIME为靶点可提高化疗疗效,该领域也是目前国内外研究的热点。但到目前为止,人们尚未描述出人PDAC的TIME全景(landscape),缺乏对其系统深入的认识。目的(1)描绘人PDAC的TIME全景;(2)阐明TIME以及常规临床病理特征与PDAC术后患者预后的关系;(3)阐明TIME与常规临床病理特征的内在联系;(4)探讨 GEM 对 TIME 的重塑效应(remodeling effect);(5)寻找并验证TIME中可以作为提高GEM疗效的最佳协同治疗靶点。方法(1)收集97例根治性胰十二指肠切除术后且行GEM辅助化疗PDAC患者的癌旁及癌组织以及17个常规临床病理信息。利用癌组织以及癌旁组织制作组织芯片。免疫组化技术标记并半定量评估15个炎性细胞群、1个新生微血管标志物、1个新生淋巴管标志物、11个免疫反应调节因子以及2个胰腺癌干细胞(Panceatic cancer stem cells,PCSCs)标志物。基于这30个因素,系统描绘人PDAC的TIME全景;(2)利用X-tile软件,定义各个因素的最佳阈值(cutoff值),然后结合单因素及多因素分析,明确与患者预后相关的独立危险因素。利用ROC曲线(receiver operating characteristic curve)分析各因素对患者死亡的预测效能;(3)利用斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数检验,系统分析TIME与常规临床病理特征中与患者不良预后相关的危险因素之间的内在联系;(4)利用GEM刺激人及小鼠PDAC细胞,利用real time RT-PCR、Western blot以及流式细胞计数计数(fluorescent cytometry,FCM)分析刺激前后肿瘤细胞中13个免疫调节因子以及PCSCs标志物的变化。然后分析GEM刺激后的PDAC细胞对巨噬细胞形态、表型及功能的影响;(5)结合前面四个部分研究的结果,寻找TIME中可以提高GEM疗效的最佳协同靶点。通过建立免疫健全小鼠皮下PDAC种植瘤模型,利用肿瘤内注射封闭抗体的方法,验证其协同作用。结果(1)首次半定量的在组织病理学层面绘制了人PDAC的TIME全景。其中GM-CSF以及TGF-β 1在绝大多数肿瘤组织中阳性或强阳性表达;(2)采用X-TILE软件定义各个因素的最佳阈值之后,在30个TIME因素以及17个常规临床病理因素中,我们明确了 22个与患者预后相关的危险因素,其中8个为独立危险因素,包括淋巴结转移、低分化、血清CA19-9升高、CD163(+)M2 型肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)、IgG4(+)浆细胞、肿瘤细胞强阳性表达GM-CSF、TGF-β1以及高密度的肿瘤组织内新生淋巴管。同时TGF-β1以及CD163(+)M2型TAM也是TIME中预测患者死亡效能最强的两个因素;(3)利用Spearman相关性检验方法,揭示了 22个危险因素之间的内在联系。结果发现GM-CSF以及TGF-β 1通过不同的途径影响PDAC的恶性生物学行为;(4)在用三个不同浓度的GEM刺激三株人PDAC细胞以及一株小鼠PDAC细胞之后,人和小鼠PDAC细胞中表达GM-CSF及TGF-β 1在mRNA以及蛋白水平均明显升高。GEM刺激后的PDAC细胞诱导M2型TAM形态、表型及功能的能力明显增强;(5)基于前面四部分研究结果:1):GM-CSF以及TGF-β1在绝大多数PDAC患者的肿瘤组织中阳性或强阳性表达;2)GM-CSF以及TGF-β1与患者预后相关的独立危险因素;3):GM-CSF以及TGF-β1通过不同的途径影响PDAC的恶性生物学行为;4):GEM化疗后,肿瘤细胞产生GM-CSF以及TGF-β1增多,我们提出在TIME中GM-CSF以及TGF-β1是与GEM协同治疗的最佳靶点。然后在免疫健全小鼠PDAC种植瘤模型中,我们利用抗体封闭肿瘤内GM-CSF以及TGF-β 1的方法,证实联合拮抗GM-CSF以及TGF-β1明显提高了 GEM的疗效。结论在综合分析肿瘤组织内炎性细胞群、免疫反应调节因子、PCSC、新生血管及淋巴管五方面的信息后,本研究首次半定量的在组织病理学水平绘制了人PDAC的TIME全景。其中GM-CSF及TGF-β 1在绝多大数肿瘤组织中阳性或强阳性表达。采用X-TILE软件,优化定义了各个因素的最佳阈值,然后在分析了 47个因素之后,我们明确了与不良预后相关的22个危险因素,其中8个为独立危险因素,包括GM-CSF及TGF-β1。在此基础上,利用Spearman等级相关检验,揭示了这22个危险因素的内在联系,并发现GM-CSF以及TGF-β 1通过不同的途径影响PDAC的恶性生物学行为。GEM刺激后肿瘤细胞表达GM-CSF以及TGF-β 1增多,从而诱导M2型TTAM的能力增强,可能是造成继发耐药的重要原因之一。我们最终确定并验证了以GM-CSF以及TGF-β 1作为最佳协同治疗靶点可明显提高GEM疗效,为PDAC综合治疗提供了新的可行途径,具有较大的临床应用前景。