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研究背景结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是一种常见的疾病,它的发病率和肿瘤相关致死率均排在恶性肿瘤前列。尽管近年来其分子遗传学相关研究进展迅速,但由于化疗抵抗的出现使得其治疗情况仍不容乐观。因此,揭示结直肠癌发生发展的内在分子机制对提高其治疗的有效性依然有重要意义。蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase,PRMTs）是催化蛋白质精氨酸残基发生甲基化的酶,从而调控多种生物学过程,如细胞内信号转导、基因表达和DNA重组等。作为II型PRMT,蛋白质精氨酸甲基转移酶5（protein arginine methyltransferase,PRMT5）可催化组蛋白和非组蛋白精氨酸残基的对称性双甲基化,在细胞生存及个体发育中扮演着重要角色。大量研究表明,PRMT5在肿瘤细胞中表达升高,这种高表达状态直接影响肿瘤的发生发展及治疗预后。尽管这些研究揭示了PRMT5在表观遗传调控中的重要性,但其调控肿瘤细胞（包括结直肠癌）生存的分子机制尚需更深入的研究。代谢重编程是肿瘤的特征性改变之一。肿瘤在快速的增殖过程中需要大量能量及大分子物质合成前体分子,为了满足这些需求,于是将代谢方式调整为有氧糖酵解,即“Warburg效应”。大量研究表明,肿瘤细胞中高度活化的糖酵解通路在调控肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）活性、肿瘤复发转移、化疗耐药等过程中发挥重要作用。肿瘤细胞在较正常细胞而言,通常具有较高的葡萄糖摄取率,随之而来是乳酸的大量积累,同时也伴随着糖酵解通路上各关键酶的表达上调;当糖酵解通路受到抑制时,肿瘤细胞的增殖和转移能力下降,且可以在一定程度上逆转化疗耐药。因此,抑制结直肠癌的糖酵解,可能达到有效抑制结直肠癌进展和化疗抵抗的目的,有利于改善结直肠癌患者的化疗预后。研究目的一、明确PRMT5在结直肠癌中的表达情况和对结肠癌细胞增殖的影响;二、证实PRMT5对结直肠癌细胞代谢表型的影响;三、探究PRMT5通过调控细胞代谢促进结直肠癌细胞增殖的分子机制;四、探索PRMT5抑制剂和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）联合应用在结直肠癌治疗中的有效性。研究方法一、PRMT5在结直肠癌组织中的表达及功能分析1.利用肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库分析PRMT5在结直肠癌中的表达情况;2.比较临床结直肠癌患者癌组织和毗邻正常结肠组织中的PRMT5 m RNA水平,利用组织芯片免疫组织化学染色检测PRMT5蛋白水平,反应PRMT5在肿瘤中的表达情况;3.构建PRMT5稳定敲降和过表达的结肠癌细胞株,利用MTT实验和克隆形成实验检测结直肠癌细胞增殖情况;4.为了明确PRMT5对增殖的影响是否依赖于其催化活性,使用两种PRMT5的小分子抑制剂JNJ-64619178和Tadalafil处理细胞,再通过MTT实验和克隆形成实验检测其细胞增殖。二、PRMT5对结直肠癌细胞代谢表型的影响1.利用高分辨非靶向代谢组学分析技术,采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪（UHPLC-Q-TOF MS）对HCT116细胞（对照组和Tadalafil处理组）样本中的代谢物进行定性定量;2.对数据进行评价和降维处理后,找出差异代谢物;3.对筛选的差异代谢物进行KEGG通路分析,探索PRMT5影响的代谢通路。三、PRMT5通过调控细胞糖酵解途径影响结直肠癌细胞增殖1.利用细胞生物能量分析仪实时检测PRMT5敲除、过表达以及小分子抑制剂JNJ-64619178和Tadalafil处理后细胞外酸化率（extracellular acidification,ECAR）和氧气消耗速率（oxygen consumption rate,OCR）的变化,反应PRMT5对结直肠癌细胞糖酵解水平的影响;2.为了阐明PRMT5对结直肠癌细胞的促增殖作用是通过影响细胞糖酵解代谢实现的,我们利用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2-DG）分别处理对照组及PRMT5过表达的结肠癌细胞,检测并分析对细胞增殖的影响。四、PRMT5调控结直肠癌细胞糖酵解代谢的分子机制1.为了探究PRMT5通过影响细胞糖酵解代谢促进结直肠癌细胞增殖的具体分子机制,我们利用实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RTQ-PCR）方法检测了糖酵解通路各代谢酶的m RNA表达情况,以找出受PRMT5影响最显著的代谢酶;2.用PRMT5抑制剂JNJ-64619178在多种结肠癌细胞系中验证该代谢酶的蛋白表达;3.利用TCGA数据库分析该酶在结直肠癌中的表达状况;4.使用小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid,si RNA）敲降该酶的表达,探讨其对结直肠癌增殖的影响;5.在对照组和PRMT5过表达的结肠癌细胞中分别利用si RNA敲降该酶的表达,分析该酶在PRMT5诱导的结肠癌增殖中的贡献;6.利用双荧光素酶报告基因实验检测PRMT5对该酶的转录调控作用,再利用和染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）实验验证其相互作用。五、探究联合应用PRMT5抑制剂和5-FU在结直肠癌治疗中的有效性1.单用5-FU或联合应用PRMT5抑制剂Tadalafil处理结肠癌HCT116和SW480细胞,利用MTT实验检测细胞增殖,在体外评估联合应用PRMT5抑制剂和5-FU在结直肠癌治疗中的有效性;2.利用裸鼠皮下移植瘤实验在体内验证联合应用PRMT5抑制剂和5-FU在结直肠癌治疗中的有效性,并检测肿瘤组织中糖酵解关键酶的表达。研究结果一、PRMT5在结直肠癌组织中呈现高表达状态,并促进结直肠癌细胞增殖1.TCGA数据库分析结果显示:PRMT5在结直肠癌中高表达;2.与癌旁组织相比,结直肠癌肿瘤组织中的PRMT5 m RNA水平显著升高;组织芯片结果提示PRMT5在结直肠癌样本中的蛋白水平显著高于正常毗邻组织样本;3.MTT实验和克隆形成实验结果表明:敲降PRMT5可使结直肠癌细胞增殖受到显著抑制,反之,过表达PRMT5可促进结直肠癌细胞增殖;4.PRMT5抑制剂JNJ-64619178和Tadalafil均可抑制结直肠癌细胞增殖。二、PRMT5对结直肠癌细胞代谢表型的影响非常广泛1.数据评价结果显示:本次试验的质控状态佳,仪器分析系统稳定性好,试验数据稳定可靠;2.本研究共鉴定出246种代谢物,有机酸及其衍生物（19.919%）、核苷类化合物及其衍生物（15.041%）和脂类及类脂分子（12.602%）是检测到代谢物数量最多的超家族;其中差异代谢物（VIP＞1且P值＜0.05）共29种;3.KEGG通路分析结果显示:丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路、氨基酸生物合成通路以及氧化磷酸化通路是受PRMT5影响最显著的代谢通路。三、PRMT5通过活化结直肠癌细胞糖酵解代谢促进细胞增殖1.敲降PRMT5或使用PRMT5抑制剂后可使结直肠癌细胞ECAR水平下降,OCR水平上调;2.糖酵解抑制剂2-DG可以消除PRMT5在结直肠癌中的促增殖作用。四、PRMT5可转录激活乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A,LDHA）的表达从而影响结直肠癌细胞糖代谢和增殖1.敲降PRMT5或使用PRMT5抑制剂可导致结直肠癌细胞糖酵解各酶的表达变化,其中对LDHA的表达影响最为显著;2.TCGA数据库分析显示LDHA在结直肠癌中高表达,敲降LDHA对结直肠癌细胞的增殖并无显著影响,但可显著影响PRMT5过表达结肠癌细胞的增殖;3.双荧光素酶报告实验结果显示,过表达PRMT5可促进LDHA的转录,Ch IP实验证实PRMT5通过H3R8me2s调控LDHA的表达。五、PRMT5抑制剂可促进5-FU的抗增殖效应1.体外细胞实验证实,Tadalafil联合5-FU能够发挥更显著的抗增殖效果;2.裸鼠皮下移植瘤实验证明,Tadalafil和5-FU的联合应用可显著抑制肿瘤生长,并且使LDHA的表达水平降低。研究结论一、PRMT5在结直肠癌组织中呈现高表达状态,并促进结直肠癌细胞增殖;二、抑制PRMT5可使结直肠癌代谢状态改变,PRMT5通过活化结直肠癌细胞有氧糖酵解促进结直肠癌细胞增殖;三、PRMT5通过转录激活LDHA的表达来促进细胞糖酵解,进而促进结直肠癌细胞的增殖能力;四、PRMT5抑制剂Tadalafil可增强5-FU的抗肿瘤效果。通过上述研究,我们证实PRMT5可通过调控细胞糖酵解代谢途径促进结直肠癌细胞增殖并阐明了其具体分子机制;同时,PRMT5抑制剂和5-FU的联合应用可显著提高结直肠癌的化疗效果,提示我们抑制PRMT5可能为结直肠癌的治疗提供了新的思路。