中医药在人类疾病的预防和治疗中占有重要地位。21世纪以生命科学、信息科学和物质科学为先导的科学技术正在不断地促进经济的繁荣和人类文化的变革。把它们的研究成果应用于中药的二次开发,加强创新中药的研究,将极大推动中药现代化的进程。世界各国实践早已证明,天然传统药物历来就是创新药物研究开发的重要源泉。在中国,结合千百年来传统医学的宝贵经验,从天然药物出发研究开发创新药物将被证明是一条捷径,创新药物的研究与中药现代化工作结合起来,必将形成中国特色。欧亚旋覆花是一种传统的中草药,为菊科旋覆花属植物欧亚旋覆花(Inula Britannica L.)的干燥头状花序,主要分布于我国、韩国和日本,我国主产于河南、河北、江苏、浙江、新疆、东北等地。该药收载于中华人民共和国药典2005年版一部,性味咸、温,入肺、肾经,主治咳嗽消痰、胁下胀满、大腹水肿、去头目风、泄散风寒。目前,报道的欧亚旋覆花的化学成分约有四十多种,主要含有甾醇、倍半萜、香豆素及黄酮类化合物,具有抗炎、抗肝损伤、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性。国内对其研究报道较少,为了搞清国产欧亚旋覆花的化学成分,阐明其活性物质基础,开拓其应用范围,我们对欧亚旋覆花中黄酮类化合物进行了系统研究,希望从中发现作用强、副作用小的有效成分或以它为先导化合物,进行深入研究。并将总黄酮研制开发成新的现代中药剂型。本文首次建立了紫外分光光度法测定欧亚旋覆花中总黄酮含量的方法;并以总黄酮含量为指标,采用L9(3)4正交设计选取最佳提取、分离工艺,通过静态和动态试验选择最佳大孔吸附树脂及纯化工艺参数;同时研究了总黄酮生物活性。从欧亚旋覆花的95%乙醇提取物的醋酸乙酯和正丁醇部分中分离出化合物单体十二个,并运用波谱分析技术结合理化性质鉴定了结构;并以得到的单体成分为对照品,建立了HPLC法同时测定五种黄酮含量的分析方法,为进一步开发利用欧亚旋覆花药材提供了物质基础和实验依据。第一部分欧亚旋覆花中总黄酮的提取分离工艺及含量测定研究第一节欧亚旋覆花中总黄酮提取分离工艺的优化目的:研究欧亚旋覆花总黄酮的提取条件和用大孔吸附树脂纯化的工艺及其参数,为开发欧亚旋覆花这一古老药用资源奠定实验基础。方法:(1)欧亚旋覆花总黄酮提取工艺的研究。根据黄酮类化合物的性质,以总黄酮含量为指标,分别用80%、60%、30%乙醇和水为提取溶剂提取,选择合适的提取溶剂;分别用超声、回流和索氏提取三种提取方法进行提取,选择最佳提取方法;采用正交试验,以总黄酮含量为指标,考察提取次数、提取时间和溶剂用量等关键因素,优化工艺条件;按所确定的最佳提取工艺条件验证试验提取工艺的可行性。(2)欧亚旋覆花总黄酮分离纯化工艺的研究。按最佳提取工艺条件制备欧亚旋覆花粗提液,测定总黄酮的含量;取X-5、S-8、NKA、NKA-9、AB-8、D4020、SP700七种大孔吸附树脂进行预处理,从总黄酮静态平衡吸附量、静态吸附动力学过程等方面,对七种大孔吸附树脂进行研究。选择一种最适宜分离欧亚旋覆花中总黄酮的树脂型号;在选定型号的树脂柱上,通过动态吸附试验确定分离欧亚旋覆花总黄酮的工艺参数。(3)AB-8大孔吸附树脂法和聚酰胺柱层析法比较欧亚旋覆花总黄酮的纯化工艺。取相同量的样品液2份,分别过聚酰胺柱和AB-8大孔吸附树脂柱,水洗脱后,分别用95%和70%乙醇洗脱,冷冻干燥,测定总黄酮的含量和回收率。结果:正交试验结果表明:提取欧亚旋覆花总黄酮的最佳工艺条件为用10倍量水,回流提取3次,每次1h。提取次数对提取工艺有显著性影响,提取时间和加水量对提取工艺没有显著性影响。验证试验结果与正交试验结果一致。从树脂静态平衡吸附量、吸附率、解吸率、吸附平衡速率常数、吸附动力学曲线等方面考察了X-5、S-8、NKA、NKA-9、AB-8、D4020、SP700七种大孔吸附树脂对欧亚旋覆花总黄酮的吸附性能。综合各项指标,结果表明,SP700型树脂虽然对欧亚旋覆花总黄酮具有吸附容量大、易解吸、富集纯度高等优点,但系进口产品。国产AB-8大孔吸附树脂对黄酮的吸附、富集、分离也有比较好的效果,且是大生产中的首选。因此,选定AB-8大孔吸附树脂富集欧亚旋覆花总黄酮;欧亚旋覆花总黄酮最佳纯化工艺参数为:提取物上样浓度0.2g/mL,以2mL/min的流速缓慢上样,用70%乙醇进行洗脱,洗脱速度为3mL/min,树脂重复利用4次。验证实验结果表明,该工艺稳定可行。采用上述工艺,欧亚旋覆花样品液中总黄酮量为10.9%;经聚酰胺法纯化后,总黄酮含量为78.2%,总黄酮回收率为49.9%;经AB-8吸附树脂纯化后,总黄酮含量为89.5%,总黄酮回收率为92.8%。结论:本文采用回流提取法,通过正交实验设计优化欧亚旋覆花总黄酮的提取工艺;首次用AB-8大孔吸附树脂,考察欧亚旋覆花总黄酮纯化工艺参数,确定了最佳分离纯化工艺。验证试验表明,工艺稳定,方法可行。用大孔吸附树脂纯化工艺制备得到的欧亚旋覆花总黄酮含量达到89.5%,为欧亚旋覆花中药制剂研制奠定了较坚实的基础。第二节紫外分光光度法测定欧亚旋覆花总黄酮含量目的:建立欧亚旋覆花中总黄酮的含量测定方法,为欧亚旋覆花药材的质量控制提供分析手段,为总黄酮提取、分离工艺的优化提供指标分析方法。方法:采用紫外分光光度法,以芦丁为对照品,水为提取溶剂,在510nm波长处,测定欧亚旋覆花中总黄酮的含量。结果:总黄酮在10.3-51.5μg/mL范围内线性关系良好,回归方程为:Y=12.2X-0.3×10-3 , r=0.9999 (n=5)。方法回收率为99.1%,RSD为1.51%(n=6)。山西、安国、江苏、河南、甘肃、内蒙、新疆七个不同产地欧亚旋覆花中总黄酮的含量测定结果表明:江苏产欧亚旋覆花中总黄酮含量最高,达8.79%;新疆产欧亚旋覆花中总黄酮含量较低,为6.28%。结论:本文首次建立欧亚旋覆花中总黄酮的含量测定方法,并对七个不同产地的欧亚旋覆花的总黄酮的含量进行了测定。该方法操作简便,结果准确,重复性好,适于欧亚旋覆花药材的质量控制。第二部分欧亚旋覆花中黄酮类单体化合物的分离及含量测定第一节欧亚旋覆花中黄酮类单体化合物的分离和纯化目的:采用系统分离法对欧亚旋覆花(Inula Britannica L.)进行分离,取醋酸乙酯和正丁醇部位分离单体黄酮,用波谱法和对照品对照法确定单体化合物的结构,为进一步开发利用欧亚旋覆花提供物质基础。方法:取欧亚旋覆花加95%乙醇回流提取,浓缩提取液得粗提物,粗提物分别用石油醚、氯仿、醋酸乙酯和正丁醇萃取,得到不同极性的物质部位。采用硅胶、聚酰胺、sephadex LH-20、大孔吸附树脂柱层析,薄层制备等分离方法,从醋酸乙酯和正丁醇部位分离单体黄酮;采用薄层层析色谱、高效液相色谱和波谱分析(EI-MS,IR,H-NMR,C-NMR,H-H COSY,DEPT,HMQC,HMBC),鉴定所得单体的化学结构。结果:从欧亚旋覆花乙醇粗提物的醋酸乙酯和正丁醇部位分离得到十二个化合物,分别是菠叶素、6-甲氧基-木犀草素、木犀草素、槲皮素、异鼠李素、山柰酚、芦丁、万寿菊苷、异槲皮苷、槲皮苷、绿原酸和小檗碱。结论:通过对欧亚旋覆花的醋酸乙酯部分和正丁醇部分提取物的化学成分的系统分离,从中分离得到十二种化合物,其中五种为首次从该植物得到。第二节高效液相色谱法同时测定欧亚旋覆花中五种黄酮的含量目的:建立同时测定欧亚旋覆花中五种黄酮(槲皮素、木犀草素、异鼠李素、菠叶素、6-甲氧基-木犀草素)含量的高效液相色谱法,为欧亚旋覆花药材及其制剂的质量控制提供依据。方法:采用反相高效液相色谱法,通过色谱条件的优化,最后确定:色谱柱:Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm,5μm),柱温40℃,以甲醇-乙腈-0.49%枸橼酸为流动相,采用梯度洗脱方式,流速1.0mL/min,检测波长为360nm,进样量20μl。并在上述色谱条件下测定了七个不同产地的欧亚旋覆花中五种黄酮的含量。结果:测定了山西、安国、江苏、河南、甘肃、内蒙、新疆七个不同产地欧亚旋覆花中五种黄酮(槲皮素、木犀草素、异鼠李素、菠叶素、6-甲氧基-木犀草素)的含量。结果表明,不同产地药材中五种黄酮的含量有明显差异,说明生态环境对药材有效成分的积累有显著影响。结论:本文首次建立了反相高效液相色谱法同时测定欧亚旋覆花中五种黄酮含量的方法,并测定七个不同产地欧亚旋覆花中五种黄酮的含量。结果表明,建立的分析方法准确可靠,灵敏度高,为欧亚旋覆花的多指标质量控制提供了可靠的分析手段。第三部分欧亚旋覆花中总黄酮的生物活性研究第一节欧亚旋覆花总黄酮对血管平滑肌细胞的增殖和迁移的影响目的:探讨欧亚旋覆花总黄酮对培养血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及迁移的影响。方法:采用大鼠胸腹主动脉的动脉中膜平滑肌细胞,用贴块法培养,实验用4-7代细胞,加入不同浓度的欧亚旋覆花总黄酮共同孵育24h。采用噻唑蓝(MTT)法观察该药对细胞增殖的影响,倒置显微镜下观察该药对细胞迁移的影响。结果:与对照组相比,欧亚旋覆花总黄酮对血管平滑肌细胞增殖具有抑制作用,该作用呈剂量依赖性;随着欧亚旋覆花总黄酮浓度增加体外培养的血管平滑肌细胞迁移距离缩短。结论:适宜浓度的欧亚旋覆花总黄酮可明显抑制体外培养的大鼠血管平滑肌细胞的增殖、迁移。第二节欧亚旋覆花总黄酮对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用目的:探讨欧亚旋覆花总黄酮对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤所致血清中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性变化的影响。方法:应用三种不同剂量的欧亚旋覆花总黄酮舌下静脉给药,采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,测定缺血2h再灌注4h后血清中MDA含量、SOD活性。结果:欧亚旋覆花总黄酮能显著降低大鼠脑缺血-再灌注后血清中MDA含量,提高SOD活性。结论:欧亚旋覆花总黄酮对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤有保护作用,其脑保护机制可能与清除自由基有关。