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肝脏纤维化（Liver fibrosis,LF）是一种由嗜肝病毒感染、脂质代谢异常、胆汁淤积、长期酗酒、自身免疫性疾病等因素导致的慢性肝脏组织损伤及炎症共同反应,是肝硬化发生的关键病理环节。中商情报大健康数据显示,2015年我国脂肪性肝脏疾病的发病总人数已超过3亿。2020年我国乙肝、丙肝和脂肪性慢性肝病患者将达到4.47亿。有效防治肝脏纤维化,是阻止病情由慢性肝炎进一步发展为肝硬化或肝癌的重要途径。鉴于目前世界各国尚无有效的上市药物用于肝脏纤维化防治,寻找有效防治肝脏纤维化的药物,日益紧迫。连翘是一种用于清热解毒、消肿散结的传统中药,能够降低炎症反应、调节血压、降低血脂、抑制病原微生物等。连翘苷（Phillyrin,PHI）是来源于连翘的天然小分子化合物,可缓解肺损伤、肾损伤、脑损伤,具有抗炎、抗氧化等广泛的药理作用。鉴于其抗炎、抗氧化的药理作用,连翘苷可能对肝脏纤维化具有保护作用。然而,连翘苷对肝脏纤维化的改善作用及机制尚不清楚。因此,本研究建立四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4）和α-萘异硫氰酸酯（Alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT）诱导的小鼠肝脏纤维化动物模型,评价连翘苷抗肝脏纤维化的药理作用;采用脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）分别刺激巨噬细胞或肝星状细胞,建立巨噬细胞炎症反应模型和肝星状细胞的活化模型,进一步研究连翘苷改善肝脏纤维化的相关机制。方法1.肝脏纤维化动物模型的建立及连翘苷给药分别用10%CCl4橄榄油溶液和含0.05%ANIT的饲料诱导C57BL/6雄性小鼠四周,建立肝脏纤维化动物模型,同时经腹腔注射方式给予小鼠PHI或生理盐水处理。通过肝脏形态学分析、肝脏功能指标谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）检测、组织病理学分析、羟脯氨酸含量测定、RT-PCR和免疫印迹等方法,评价PHI抗肝脏纤维化的药理作用。2.MTT实验考察细胞增殖采用0.1μM-100μM的连翘苷分别孵育L02、HSC-T6、LX-2、RAW264.7细胞24h、48h、72h,通过MTT实验考察细胞的增殖活性;用LPS分别刺激RAW264.7和HSC-T6细胞,并给予细胞PHI处理,通过MTT实验考察细胞的增殖活性。3.Transwell实验检测细胞迁移活性采用LPS刺激RAW264.7和HSC-T6细胞迁移,并给予细胞PHI处理,通过Transwell实验检测细胞迁移活性。4.ELISA检测细胞炎症因子水平采用LPS刺激RAW264.7和HSC-T6细胞,并给予细胞PHI处理,利用ELISA检测细胞炎症因子水平。5.流式细胞术检测细胞ROS水平采用LPS刺激HSC-T6细胞,并给予细胞PHI处理,利用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。6.免疫荧光检测细胞蛋白表达及核转位采用LPS刺激RAW264.7细胞,细胞因子TNF-α和TGF-β1分别刺激LX-2细胞,并给予细胞PHI处理,通过免疫荧光实验检测NF-κB p65蛋白核转位以及α-SMA蛋白表达和Smad2/3蛋白核转位。7.免疫印迹检测蛋白表达及磷酸化采用LPS分别刺激RAW264.7和HSC-T6细胞,细胞因子TNF-α和TGF-β1分别刺激LX-2细胞,通过免疫印迹实验检测α-SMA蛋白表达及NF-κB p65蛋白和Smad2/3蛋白磷酸化水平。结果1.在CCl4和ANIT诱导的小鼠肝脏纤维化模型中,连翘苷能够显著改善肝脏纤维化。PHI组的肝脏组织损伤程度、胶原含量以及炎症和纤维化相关基因的表达都有所降低。同时,PHI组中NF-κB p65蛋白和Smad2/3蛋白磷酸化水平相对于模型组都显著下降。2.0.1μM-30μM PHI在72h内对L02、HSC-T6、LX-2、RAW264.7细胞增殖作用无影响;PHI对LPS诱导RAW264.7和HSC-T6细胞的增殖、迁移具有明显的抑制作用。3.PHI能够显著抑制LPS诱导HSC-T6细胞ROS的产生,以及抑制巨噬细胞和肝星状细胞炎症因子的分泌和NF-κB p65蛋白磷酸化。4.PHI能够显著抑制肝星状细胞α-SMA蛋白表达及Smad2/3蛋白磷酸化。结论连翘苷对小鼠肝脏纤维化具有明显的改善作用,其机制与抑制NF-κB信号通路和TGF-β1/Smad2/3信号通路,进而调节巨噬细胞介导的炎症反应和抑制肝星状细胞的活化有关。