作用于昆虫鱼尼丁受体的邻甲酰氨基苯甲酰胺类化合物氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺是具有作用机理独特、低毒高效、与环境友好的新型高效杀虫剂。随着近年的大面积使用,田间害虫对氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺的抗性逐渐显现,因此发现作用于鱼尼丁受体的新化合物是解决害虫对该两个化合物抗性的方法之一。昆虫鱼尼丁受体是由4个分子量为560 Kd亚基构成的大分子跨膜蛋白,难以获得其三维空间结构,限制了作用于鱼尼丁受体同活性化合物之间的相互作用研究。因此,建立合适的方法和技术研究活性化合物同昆虫鱼尼丁受体的相互亲和作用,也是目前杀虫剂活性小分子发现研究的热点之一1、 本论文通过活性亚结构拼接的方法将酰肼结构引入邻甲酰氨基苯甲酰胺结构中,同时在母体苯环上引入碘原子和氰基,设计合成了系列邻酰氨基苯甲酰肼类化合物,所有化合物的结构通过了核磁共振氢谱的确认。初步的生物活性研究,发现部分化合物对粘虫具有一定的致死活性,其中化合物cau-Ikc1、cau-lkc2和cau-lkc5(如图1)在100 mg门L的浓度下对粘虫的致死率达到100%。2、通过匀浆、离心等方法提取了美洲大蠊腿部含鱼尼丁受体的膜蛋白,并通过Bradford法对膜蛋白提取物中的鱼尼丁受体蛋白进行了确认和含量的测定,结果显示美洲大蠊提取物中鱼尼丁受含量为69 μg/mL。3、利用已有的荧光配体,基于荧光偏振技术建立邻甲酰氨基苯甲酰胺化合物同昆虫肌肉中鱼尼丁受体膜蛋白的亲和作用研究。结果显示(如图2)氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺均可竞争性抑制氯虫苯甲酰胺荧光配体和昆虫鱼尼丁受体的结合,氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺抑制荧光配体和昆虫鱼尼丁受体结合的IC50分别为135.65 nM和146.36 nM；而结构骨架不同的氟苯虫酰胺则不能抑制氯虫苯甲酰胺荧光配体和昆虫鱼尼丁受体的结合。该结果说明氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺作用于昆虫鱼尼丁受体的同一位点,而氟苯虫酰胺作用于昆虫鱼尼丁受体的其他位点。同时,建立的邻甲酰氨基苯甲酰胺化合物同昆虫肌肉鱼尼丁受体相互亲和作用方法的Z’因子达到0.76,说明该方法适用于高通量筛选作用于昆虫鱼尼丁受体邻甲酰氨基苯甲酰胺(氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺)结合位点的活性化合物,对作用于鱼尼丁受体高效新化合物的创制具有重要意义。4、根据半抗原的特性要求,利用氨基丁酸取代氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺母体结构中的甲基氨基,设计并合成了含氯虫苯甲酰胺结构和溴氰虫酰胺结构的半抗原(如图3)。然后经过免疫抗原的制备、小鼠免疫、抗体评价等成功制备了氯虫苯甲酰胺抗单克隆抗体1D2和溴氰虫酰胺单克隆抗体3B2.5、利用ELISA技术建立了研究双酰胺类化合物同氯虫苯甲酰胺抗体和溴氰虫酰胺抗体亲和作用的方法,进一步研究抗体模拟鱼尼丁受体的结合特性。测试结果显示,氯虫苯甲酰胺间接竞争ELISA的IC50为1.60 ng/mL溴氰虫酰胺间接竞争ELISA的1C50为1.57mg/mL活性化合物同抗体的亲和作用结果表明,抗体和受体蛋白一样能够识别性结合半抗原中的母体结构,但是具有很强的特异性,对于其它类型的化合物也有一定的识别。该研究对促进研究昆虫鱼尼丁受体和活性化合物的亲和作用研究具有一定意义。6、基于溴氰虫酰胺单克隆抗体的特异性,利用ELISA技术建立了溴氰虫酰胺icELISA检测方法。该方法的IC50为1.57 ng/mL,检测范围为0.43-6.15 ng/mL(如图4),检测溴氰虫酰胺在小白菜和自来水中的添加回收率分别为93.7-101.0%和94.4%-101.6%。建立的间接竟孝ELISA方法可以对小白菜样品和水样中的溴氰虫酰胺残留进行快速准确测定。