真菌侵染引起的果实贮藏期病害是导致柑橘果实采后腐烂的主要原因,每年造成柑橘产业的巨大经济损失,以指状青霉和酸腐病菌侵染引起的绿霉病和酸腐病最为严重。化学杀菌剂可有效控制柑橘采后病害发生,但残留量大、毒性强、易诱导病原菌产生抗性。前人研究表明,植物精油可显著抑制对多种果蔬采后致病菌的生长,具有安全、高效和无残留等优点,是一类潜在生物抑菌剂。本课题组前期研究发现,柠檬醛和肉桂醛等多种精油组分可显著抑制指状青霉和酸腐病菌生长,对柑橘采后绿霉病和酸腐病控制效果较好,在柑橘防腐保鲜方面有潜在的应用前景,但对应的抑菌机理尚不明确。本研究拟揭示柠檬醛和肉桂醛等对指状青霉和酸腐病菌的抑菌机理,在此基础上筛选出可用于柑橘果实采后病害的精油组合,以期为柑橘防腐保鲜提供理论和技术参考,所得主要研究结果如下:(1)柠檬醛抑制指状青霉菌丝体生长的机制研究研究发现,柠檬醛可利用其亲脂特性进入指状青霉细胞,降低指状青霉总脂质和麦角固醇含量,诱导丙二醛和H2O2积累,导致膜脂过氧化损伤,破坏细胞膜完整性。RNA-seq结果显示,1/2最小抑菌浓度(MIC)柠檬醛处理指状青霉后,ABC转运、糖酵解/糖异生、固醇代谢等受到显著影响。荧光定量PCR结果显示,1/2MIC柠檬醛处理后,指状青霉麦角固醇合成途径基因ERG11、ERG6、ERG3和ERG5的表达显著下调。其中,ERG11的表达始终低于对照组,很可能是柠檬醛影响指状青霉麦角固醇合成的潜在关键基因。iTRAQ结果显示,1/2MIC柠檬醛主要影响与ROS和ATP生成相关的线粒体氧化磷酸化途径。其中,线粒体复合体酶Ⅰ和酶Ⅳ活性被抑制,而线粒体复合体酶Ⅱ、酶Ⅲ和酶Ⅴ活性增加。这些酶活性的变化引起活性氧(ROS)大量积累,抗氧化酶活性增强,谷胱甘肽、胞内ATP含量和线粒体膜电位降低。外源添加半胱氨酸可延缓指状青霉ROS积累和膜损伤。以上结果表明,柠檬醛可通过抑制指状青霉麦角固醇合成、影响氧化磷酸化、诱导ROS积累等多种方式发挥抑菌作用。(2)不同精油组分对指状青霉麦角固醇代谢的影响研究研究发现,1/2MIC香茅醛、丁香酚和α-松油醇处理后,指状青霉抑霉唑敏感菌株和抗性菌株细胞膜完整性被破坏,麦角固醇合成途径中间代谢物成分、羊毛固醇和麦角固醇含量以及麦角固醇途径基因的表达被显著改变。外源添加适宜浓度麦角固醇可影响这三种物质对敏感菌株和抗性菌株的抑制效果,修复被精油组分破坏的细胞膜、恢复胞内麦角固醇含量,改变麦角固醇合成途径中间代谢产物成分,且减小处理组与对照组测试基因的表达差异。1/2MIC香茅醛处理后,敏感菌株和抗性菌株的羊毛固醇含量增加,麦角固醇含量降低,敏感菌株麦角固醇合成相关基因(ERG6除外)及抗性菌株的基因ERG5和ERG26表达在30 min时被抑制,其中ERG11和ERG26分别是香茅醛影响敏感菌株和抗性菌株麦角固醇合成的潜在作用位点。1/2MIC 丁香酚处理后,敏感菌株羊毛固醇含量增加而抗性菌株中含量降低,敏感菌株和抗性菌株麦角固醇含量均增加。荧光定量PCR结果表明,丁香酚可通过抑制敏感菌株和抗性菌株的主链基因ERG4表达从而阻碍麦角固醇合成,但可通过开启麦角固醇合成侧链支路以弥补该损失,刺激麦角固醇含量增加。1/2MIC α-松油醇处理后,指状青霉麦角固醇含量降低,敏感菌株羊毛固醇含量增加但抗性菌株中羊毛固醇含量降低。此外,α-松油醇处理后,敏感菌株ERG27和抗性菌株ERG9表达量始终低于对照组,暗示α-松油醇对敏感菌株和抗性菌株的抑制作用很可能与ERG27和ERG9有关。(3)肉桂醛抑制酸腐病菌菌丝体生长的作用方式研究研究发现,1/2MIC肉桂醛处理30min时,酸腐病菌胞外碱性磷酸酶活性显著提高,且菌丝体细胞壁荧光与对照组相比显著变弱,酸腐病菌细胞壁通透性和完整性被破坏,随着时间延长到120 min,细胞膜受损严重,但脂质和麦角固醇含量基本保持不变。此外,肉桂醛处理期间,H2O2含量未显著升高,表明酸腐病菌未发生明显的氧化胁迫。RNA-seq结果显示,1/2MIC肉桂醛处理酸腐病菌后,MAPK信号通路、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢。荧光定量PCR结果表明,1/2MIC肉桂醛处理后,酸腐病菌几丁质合成相关基因(CHS2、chsA、chsB、chsG和UAP1)和葡聚糖水解相关基因(Glu1和Glu2)表达下调,几丁质水解相关基因CHI1表达被诱导,这些基因的表达结果与酸腐病菌几丁质含量变化保持一致。结合以上结果可以看出,肉桂醛可通过抑制酸腐病菌细胞壁几丁质合成,加速几丁质水解,破坏酸腐病菌细胞壁完整性,从而抑制酸腐病菌生长。(4)肉桂醛和柠檬醛等复配对绿霉病和酸腐病的控制效果通过比较发现,肉桂醛+柠檬醛(v/v:1:4)和肉桂醛+香茅醛(v/v:5:16)组合可显著抑制指状青霉菌丝体生长,最小杀菌浓度(MFC)分别为0.80和0.40μL/mL。这些组合可协同增效抑制指状青霉孢子萌发、干扰细胞壁形成以及破坏细胞膜完整性;肉桂醛+柠檬醛(v/v:1:2)和肉桂醛+香茅醛(v/v:5:16)显著抑制酸腐病菌菌丝体生长,MFC分别为0.80和1.60 μL/mL,这些组合可协同增效抑制酸腐病菌孢子萌发和扰乱细胞壁形成。活体实验结果表明,果蜡添加0.40μL/mL和16.00 μL/mL肉桂醛+香茅醛(v/v:5:16)对接种指状青霉和酸腐病菌的宫川果实防腐效果最佳,当对照组腐烂率达到100%时,上述处理组果实腐烂率分别为38%(5 d)和53%(8 d),且对果实失水率、着色指数、硬度、pH、可溶性固形物、固酸比、Vc含量无不利影响。本研究揭示了柠檬醛和肉桂醛抑制指状青霉和酸腐病菌的作用机制,筛选出可显著降低采后绿霉病和酸腐病的精油组合,可为植物精油的抑菌研究和抑菌剂开发提供较好的理论参考。