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向解除葡萄糖抑制的酵母细胞中(在非发酵碳源上生长或进入稳定期的细胞)加入葡萄糖对胞内合成cAMP产生刺激性的作用,使胞内cAMP水平短暂快速升高,依赖cAMP的蛋白激酶A(PKA)被激活,胞内发生蛋白磷酸化级联反应。葡萄糖作为信号分子由Cdc25/Ras/adenylyl cyclase信号通路介导,在这条信号通路中,Cdc25p是Rasp的鸟苷酸交换因子(GEF),其功能是催化Rasp的GDP/GTP交换反应。已有研究表明:Cdc25p是一种磷酸化蛋白,葡萄糖诱导后,PKA被激活并将Cdc25p超磷酸化修饰;Cdc25p被磷酸化修饰后定位由胞膜向胞质迁移,与膜上Rasp的结合减弱。所有这些结果均表明:Cdc25p可能是PKA对胞内cAMP水平反馈抑制的靶标之一。但是,目前为止还没有证据证明Cdc25p的磷酸化修饰可以减弱其GEF活性,进而从合成水平上反馈抑制Ras-cAMP信号通路。本论文的主要内容是研究酿酒酵母PKA通过磷酸化修饰Cdc25p来反馈抑制Ras-cAMP信号通路的作用机制,通过体外实验证明了Cdc25p被磷酸化修饰后,其对Rasp的GEF活性减弱。同时,还对不同TPK基因产物通过磷酸化Cdc25p对Ras-cAMP信号通路的反馈抑制作用进行研究。
实验结果表明:PKA通过磷酸化修饰Cdc25p对Ras-cAMP信号通路反馈抑制,且这种反馈抑制作用并不依赖于Yak1,Tor1,Rim15,Sch9激酶。
在酿酒酵母细胞中,BCY1基因编码PKA的调节亚基,TPK1,TPK2和TPK3基因编码催化亚基。首先,我们构建不同PKA活性的突变株:敲除BCY1基因,并保留一个或两个TPK基因的突变株PKA活性高;同时敲除三个TPK基因和YAK1基因的突变株PKA活性低。实验结果表明:高PKA活性的突变株中,Cdc25p被超磷酸化修饰,胞内Ras2-GIP相对含量低,且单位质量Cdc25p结合的Ras2-GTP少;反之,低PKA活性的突变株中,Cdc25p不能被磷酸化修饰,胞内Ras2-GTP相对含量高,且单位质量Cdc25p结合的Ras2-GTP多。这些结果表明:酿酒酵母PKA对Ras-cAMP信号通路的反馈抑制机制之一是通过PKA对Cdc25p的磷酸化修饰从合成水平上反馈抑制Ras-cAMP信号通路。
体外实验结果表明:Cdc25p被磷酸化修饰后,其对Rasp的GEF活性减弱,揭示了PKA通过磷酸化修饰Cdc25p对Ras-cAMP信号通路反馈抑制的机制。
实验结果还表明:敲除BCY1基因后,三个TPK基因产物也分别能磷酸化修饰Cdc25p,并使胞内Ras2-GTP相对含量低,单位质量Cdc25p结合的Ras2-GTP少。由此揭示:在解除了BCY1基因产物对TPK基因产物的负调控作用后,TPK基因产物磷酸化修饰Cdc25p,从合成水平上反馈抑制Ras-cAMP信号通路。