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根据中医中药关于肿瘤生成发展的相关理论和实践，我们精选了50多种具有温中益气、活血化淤等特性的中药活性成分单体，建立初筛样品库。用本所建立的肿瘤多药耐药的体外模型k562／ADR等耐药细胞系进行体外筛查，发现五味子属植物中的一个活性单体五味子乙素(Schisandrin B，SchB)具有有效逆转肿瘤多药耐药(Multidrug resistance，MDR)的能力。SchB是从五味子果仁中提取的有效单体，属联苯环辛烯类化合物。根据初筛结果，本研究从以下五个方面对SchB的作用效果和机制分别研究。 1．体外逆转效果评价 本研究选用三株耐药细胞K562／ADR，K562／VCR和KBV200，经验证均高表达P-gp。在初筛证明6ug／ml SchB可逆转K562／ADR对阿霉素(adriamycin，ADR)的基础上，用不同浓度的SchB进行ADR的体外逆转实验，表明在10ug／ml SchB时可与6ug／ml维拉帕米(verapamil，VER)相当，而相对应的毒性比VER小。为确认SchB是否具有广谱逆转特性，选择不同结构和机制的抗癌药物如蒽环类、生物碱类、表鬼臼毒素类、抗微管类、抑制蛋白合成类等进行体外细胞学的逆转实验，发现SchB在6ugm／l和10ug／ml时均能显著增强K562／ADR，K562／VCR和KBV200对药物的敏感性，10ug／mlSchB与阳性对照6ug／ml的VER效果相当。流式细胞仪检测证实SchB能明显增加阿霉素和柔红霉素在K562／ADR细胞中积聚，相较对照组有3-5倍以上的增加。HPLC检测阿霉素在K562／ADR细胞的外排，发现该化合物能有效降低阿霉素的外排，效果与浙江大学硕士学位论文阳性对照VER相当。Rh一123是一种具有荧光的P一gP底物，由于对细胞的毒性较荧光抗癌药物小，可真实的替代药物反映其在细胞内的积聚和外排。所以我们进一步采用Rh一123作为替代底物，通过流式细胞仪评估SChB对KBVZOO细胞外排与积聚Rh123的影响，实验发现SChB在10ug/ml时其积聚Rh123的能力显著增强，而外排能力被显著抑制，与通过MTT获得逆转工CSO的结果基本一致。 2.对P一gP高表达的耐药细胞中DNR异常分布影响 化疗药物在敏感细胞中一般呈弥散性分布，而在耐药细胞中表现为特定亚细胞器的异常分布，此现象是肿瘤耐药的一个常见因素和特征。本研究证明sChB和vER具有类似的效果，可有效改变DNR在P一gP介导的耐药细胞内的异常分布，恢复药物弥散性分布，推测这种异常分布及其恢复可能与药泵蛋白P一gp的功能相关。同时，用线粒体特异荧光探针Rh一123作为对照，发现 Rh一123在耐药细胞中的分布(主要为线粒体)与DNR的分布有明显区别，初步判断DNR不在线粒体中分布，SehB和VER均可恢复Rh一123在耐药细胞中的亚细胞分布异常，其中10ug/ml VER的恢复效果比IOug/ml SchB略好。但DNR等化疗药物在P一gp介导的耐药细胞中具体细胞器的分布还需要进一步的实验验证。 3.SchB和ADR联合用药的增敏效果 逆转剂的主要作用方式是增强化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力，因此该部分从凋亡增敏的方向研究SChB和ADR联合用药对KBVZOO的杀伤效果。主要采用了MTT，流式细胞术、PS检测、琼脂糖凝胶电泳技术检测阿霉素与五味子乙素合用时的诱导细胞凋亡的程度，实验结果显示单用lug/ml和sug/m1阿霉素只引起较少的细胞凋亡，而阿霉素与五味子乙素合用可极显著增加细胞凋亡的百分率(P<0.001)。所以，五味子乙素可有效增敏阿霉素诱导的人口腔鳞癌KBVZOO多药耐药细胞的凋亡。实验中还发现，无论是SChB还是VER都不能完全逆转KBV200的抗性至同浓度ADR诱导KB时的凋亡效果，提示在KBVZOO的耐药机制中除pgP高表达外，还可能有其它的耐药机制存在。浙江大学硕上学位论文 4.分子机制的初步研究 用流式细胞仪检测P一gP荧光抗体标记的三种耐药细胞系，发现P一gp蛋白均高表达。COCI/DDP耐药细胞系为用顺铂(DDP)诱导的人卵巢癌耐药细胞，研究证实该细胞GST高表达而P一gP表达阴性。用DDP、5一FU、VCR等化疗药物作SChB的逆转MTT实验，发现无明显逆转效果，说明SchB可能不具有下调GST表达或抑制其功能的作用。通过RT一PCR证实SchB可一定程度下调mdrl基因的转录;流式细胞仪进行抗体检测发现P一gP蛋白表达亦有显著下调。我们分析，本论文第一部分研究发现SChB能增加药物积聚和阻滞外排，但通过下调基因或蛋白表达需要较长时间，所以不能说明其积聚药物减弱外排的作用，推测该化合物可能为P一gP的竞争性底物或别构调节物，经3H一azidopine的亲和标记实验证实SChB可竞争性抑制P一gP。至于是否同时有蛋白酶类、通路类的作用，有待进一步的研究证明。 5.动物体内药效研究 用体外原代培养的人淋巴细胞(单核细胞)、人成纤维细胞和人骨髓间充质细胞等验证不同浓度SChB的毒性反应，发现SChB在20ug/ml以下无任何可观测到的正常细胞毒害作用，4Oug/m1时的细胞毒作用仍然十分轻微，而vER在10一15ug/耐时就有明显的细胞毒性反应。用Balb/C裸鼠作动物毒性检验发现，20mg/鼠连续灌胃4天，随后观测10天，发现无可观察到的伤害。为验证SchB体内药效，我们用人耐药细胞KBV200接种Balb/c裸鼠，