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研究背景急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)发生率长期居高不下。患者一旦发生AKI,不仅住院死亡率大大增加,同时远期心血管事件发生及进入终末期肾脏病(End stage renal disease,ESRD)的几率明显升高。其中缺血再灌注AKI是急性肾损伤的重要原因,是我国医院获得性急性肾损伤的首要原因。急性肾小管坏死(acute tubular necrosis,ATN)是缺血再灌注AKI的重要病理生理特征。既往认为肾小管上皮细胞坏死不可调控,最近十年的研究提出了几种新的细胞坏死形式,并发现这些坏死形式存在可被调控的可能。在这些坏死形式中necroptosis是一种重要的可调控性细胞坏死。研究显示Necroptosis参与了缺血再灌注AKI的发生,使用necroptosis的抑制剂necrostatin-1可以减轻缺血再灌注引起的肾损伤。受体相关蛋白激酶-1(receptor-interacting protein kinase-1,RIP-1)和受体相关蛋白激酶-3(RIP-3)是介导necroptosis的重要蛋白。当RIP-1和RIP-3激活后不仅可以磷酸化混合系列蛋白激酶样结构域(mixed-lineage kinase domain-like,MLKL)导致细胞膜破裂,继发细胞坏死;同时可以通过促进线粒体分裂和增加活性氧自由基(reactive oxide species,ROS)导致细胞坏死。但是在肾小管上皮细胞necroptosis的发生发展过程中线粒体分裂和ROS所起的作用尚未清楚。我们考虑通过建立一个稳定的肾小管上皮细胞在缺氧状态下的necroptosis模型,通过观察肾小管上皮细胞发生necroptosis时线粒体分裂的情况以及ROS的变化,以求探究他们在肾小管上皮细胞necroptosis中所扮演的角色。目的建立肾小管上皮细胞缺氧状态下的necroptosis模型,并观察线粒体分裂和ROS在肾小管上皮细胞necroptosis中的损伤作用。研究方法使用TNF-α、Z-VAD及antimycin在大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E上建立缺氧状态下凋亡样坏死细胞模型,观察necrostatin-1对NRK-52E的保护作用。检测necroptosis时NRK-52E细胞中调控线粒体分裂的动力相关蛋白-1(dynamin-related protein 1,Drp-1)的变化,并通过 mitotracker 观察线粒体分裂情况,从容探讨线粒体分裂在肾小管上皮细胞necroptosis中的损伤性作用。使用TNF-α、Z-VAD及antimycin在人近端肾小管上皮细胞HK-2上建立缺氧状态下凋亡样坏死细胞模型,检测necroptosis时ROS的变化,观察necrostatin-1以及NADPH氧化酶抑制剂二苯基氯化碘(Diphenyliodonium chloride,DPI)对ROS的影响以及对HK-2细胞的保护作用。结果使用 TNF-α 10 ng/ml、Z-VAD 50 μmol/L 及 Antimycin A 10 μmol/L 对NRK-52E 细胞进行干预,发现 TNF-α(T)组及 TNF-α +Antimycin A(TA)组细胞凋亡明显增加,而TNF-α+Antimycin A+ Z-VAD(TZA)组较T及TA组凋亡细胞减少,但坏死细胞明显增多,且necroptosis关键调节蛋白RIP-1及RIP-3均明显升高。而对TZA组进行Nec-1预处理,发现Nec-1可以减少TZA诱导的细胞坏死,降低RIP-1及RIP-3水平。TZA组较对照组细胞Drp-1表达水平明显升高,同时线粒体分裂增加,而Nec-1可以抑制TZA组细胞Drp-1的升高及线粒体分裂;使用siRNA沉默Drp-1可以减少线粒体分裂,并减轻TZA所诱导的细胞坏死。根据课题组前期研究结果,在HK-2细胞中同样使用TNF-α、Z-VAD及Antimycin A建立necroptosis模型。在TZA组中发现ROS水平明显增加,而使用Nec-1可以抑制TZA所致ROS增加。对TZA组细胞使用NADPH氧化酶抑制剂DPI干预,可以减少ROS生成,并减少细胞坏死。结论本研究初次在大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E中建立了缺氧所致necroptosis模型,并证实Nec-1可以减轻缺氧所致肾小管上皮细胞necroptosis。同时发现,Drp-1介导的线粒体分裂参与了肾小管上皮细胞necroptosis。在HK-2细胞的necroptosis模型中,ROS参与了肾小管上皮细胞necroptosis,并且通过抑制ROS的生成可以减轻肾小管上皮细胞necroptosis。