论文部分内容阅读
结直肠癌属于一种发病率高且死亡率高的恶性消化道肿瘤，它在发病初期的症状并不明显，导致患者确诊时多为晚期癌症。结直肠癌在术后容易复发并且对放疗和化疗的敏感性较差，因此寻找结直肠癌的有效临床检测指标以及潜在的有效治疗靶标显得尤为重要。 硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD1)是调节脂肪酸不饱和度的关键限速酶，它为肿瘤增殖所必需的膜磷脂等提供了重要的成分来源。目前已有的研究证明SCD1在一些常见肿瘤组织中的基因表达及蛋白水平均高于正常组，它与肿瘤的恶化进程呈一定的正相关关系。SCD1的表达水平有可能成为肿瘤诊断及预后的重要生物标志物之一。抑制SCD1后发现肿瘤细胞出现增殖受阻以及凋亡的现象，这进一步说明SCD1是肿瘤发展过程中必不可少的代谢酶。此外，作为生物脂类的重要组成之一，神经酰胺在诱导肿瘤凋亡的研究报道也越来越多。作为生物体内脂类调控网络的重要成员，关于SCD1和神经酰胺在调控肿瘤细胞凋亡上的关联性研究显得更为重要。SCD1抑制后是否依赖神经酰胺从而促进肿瘤细胞的凋亡？针对这一疑问，本文提出假设:在小分子抑制剂抑制SCD1的活性后，结肠癌细胞内神经酰胺的从头合成能力增强从而提高神经酰胺的含量，进而诱发线粒体功能紊乱，最终导致结肠癌细胞凋亡。为了验证这一设想，论文的实验内容分为以下几部分: 一、结直肠癌组织样本中SCD1表达水平及神经酰胺含量水平检测 收集45例结直肠癌患者的肿瘤样本以及癌旁正常样本，分别用Real-timePCR以及Western blot方法检测SCD1的基因水平及蛋白表达水平，利用液相质谱联用技术(LC-MS/MS)检测长链神经酰胺的含量。结果发现结直肠癌样本中SCD1的表达水平明显高于癌旁组织，并且肿瘤组织中C16∶0、C24∶0、C24∶1神经酰胺的含量明显增高，而C18∶0与C20∶0神经酰胺的含量则偏低。 二、SCD1抑制剂对结直肠癌细胞增殖的影响 检测Colo205、LOVO、HCT15、LS1034、LS180、HCT116、HT29等7种肠癌细胞系中SCD1的基因水平及蛋白表达水平。给予不同浓度的SCD1小分子抑制剂A939572后，利用CCK8法检测结直肠癌细胞的增殖情况。发现SCD1抑制剂可以普遍抑制结直肠癌细胞的增殖，且抑制效果呈浓度梯度依赖。 三、SCD1抑制剂提高结直肠癌细胞内神经酰胺的从头合成产量 选取对SCD1抑制剂较为敏感的LOVO及Colo205细胞作为实验对象，同时或分别给予两种不同结构类别的SCD1抑制剂A939572/Cay10566和神经酰胺从头合成酶抑制剂L-cycloserine后，使用CCK8法检测肠癌细胞的增殖情况，利用流式细胞术对肿瘤细胞的凋亡状态进行检测，使用Wester blot法检测凋亡蛋白的表达水平，采用液质联用法(LC-MS/MS)检测脂肪酸不饱和度以及神经酰胺水平的变化。结果显示抑制SCD1促进了结直肠癌细胞内神经酰胺的从头合成，提高长链神经酰胺的表达水平从而促进了细胞的凋亡。 四、SCD1抑制通过促进长链神经酰胺的从头合成诱导线粒体功能紊乱 同时或分别给予SCD1抑制剂A939572和神经酰胺从头合成酶抑制剂L-cycloserine后，使用流式细胞术检测结直肠癌细胞中的活性氧含量及线粒体的膜电位变化，采用Western blot法检测线粒体内细胞色素C的释放情况。实验结果显示在SCD1活性被抑制后，肿瘤细胞通过提高神经酰胺的从头合成能力，升高细胞内活性氧水平，进而改变线粒体膜电位，促使线粒体内细胞色素C释放到胞浆内，最终诱发了线粒体功能的紊乱。 五、SCD1抑制后升高长链神经酰胺水平从而抑制裸鼠结直肠癌组织的增殖。 在裸鼠荷瘤模型中，用腹腔注射方式同时或分别给予SCD1抑制剂A939572和神经酰胺从头合成酶抑制剂L-cycloserine后监测肿瘤的增长速度以及裸鼠体重变化。结果发现SCD1抑制剂可以抑制肿瘤的增长速度，而神经酰胺从头合成抑制剂可以逆转这一现象。