高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是引起宫颈癌(cervicalcancer，CC)发生的重要因素。在女性生殖道中约发现超过40种人乳头瘤病毒，其中15种为与宫颈癌发生相关的高危型(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73和82)。HPV16和HPV18是最常见的与宫颈癌相关的型别，而非HPV16/18型在宫颈细胞内瘤样变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的分布有着显著的地域性差异。我们的前期研究显示HPV58型占中国东北地区宫颈癌患者第二位，感染率为7.79％。然而，并非所有高危型HPV感染都会最终进展为恶性病变，一般认为长期持续的HPV感染会导致患者从CIN逐步进展为宫颈癌，同时有研究显示某些特异的型内变异可能会影响HPV的持续感染而最终导致癌前病变转变为癌症。　　 HPV的潜在致癌性主要与E6和E7两个致癌蛋白有关。HPV E6和E7蛋白分别通过使肿瘤抑制因子P53和视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein， pRb)功能失活而控制细胞周期和凋亡。L1蛋白是HPV主要的衣壳蛋白，能够自己装配成病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)从而诱导高水平的中和抗体产生并在动物感染动物乳头瘤病毒后的模型中显示出很高的保护性。由于氨基酸序列的替换可能会影响L1蛋白的结构、功能或抗原特性，所以研究L1区域的改变将对定义设计疫苗和诊断药物的相关表位有重要意义。HPV长控制区(long control region，LCR)包含DNA复制起始，增强元件和转录增强序列，是主要的病毒转录调控区。LCR通过与转录因子的相互作用，调节早期区基因的转录。目前，国际上关于HPV基因变异导致宫颈病变的研究主要集中在HPV16和HPV18型，关于HPV58变异情况的研究数据很少。　　 高危型HPVs持续感染导致宫颈癌的发生是一个多因素，多阶段，长时间的累积过程，约80％的女性在其一生中会感染HPV，而最终仅一小部分患者会发展为宫颈癌。因此，除了病毒自身的结构特点外，感染病毒载量及病毒整合情况等可能都对宫颈癌的发生有影响，病毒载量可能为一个早期检查或预测高度宫颈病变和宫颈癌的一个标志物。最近的研究数据显示高危型病毒载量与高度鳞状上皮内细胞病变（high grade squamous cell intra-epithelial lesions，HSILs）高度相关。　　 HPVDNA在良性肿瘤和低度癌前病变中多以游离形式存在，而在恶性病变及高度癌前病变中常以单拷贝或多拷贝整合于宿主细胞基因组中。病毒基因整合入宿主细胞的部位通常发生在E1或E2区。病毒整合时，E2的断裂或缺失导致其开放阅读架失活，对病毒癌基因表达负反馈调节作用缺失，使E6、E7基因过度表达而导致细胞生长失控。因此可以通过E2/E6比来了解HPV与宿主细胞的整合状态，评价宫颈病变的恶性程度。目前，有关HPV整合的研究大多数针对HPV16和18型，研究显示HPV在不同宫颈病变中的整合率随HPV感染型别的不同而变化。　　 由于HPV58在中国乃至亚洲妇女中有着相当高的流行率及致癌性，本课题分析了HPV58型的E6、E7、L1基因及LCR的的基因变异情况与宫颈病变的相关性。通过对感染的HPV58型病毒载量的测定及其与宿主细胞的整合状态的分析，分析其与宫颈病变的相关性，探讨HPV58型在宫颈病变发生中的致病机制。　　 实验方法　　 1、采用HybriMax法对2938例宫颈拭子标本进行HPV基因分型检测，筛选出235例标本为单一HPV58型感染，按其对应的病理组织学诊断分组:正常细胞47例，慢性或急性宫颈炎症127例，ASCUS19例，CIN-1为15例人，CIN-2和CIN-3为23例，宫颈癌4例。采用半巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分别扩增E6、E7、L1基因及LCR调控区，然后对其扩增产物进行纯化测序，并与HPV58型标准株比较，分析不同宫颈病变患者的HPV58型各基因变异情况。　　 2、于中国医科大学附属盛京医院妇产科进行宫颈癌机会筛查的女性中选出102例单一HPV58型感染的阳性标本，同时按其宫颈脱落细胞或宫颈组织进行细胞学及组织学评价，分为正常及宫颈炎组34例、LSILs组31例，及HSILs组28例，CC组9例。通过实时荧光定量PCR测定，以E6的含量作为HPV58型的病毒载量，以E2与E6基因的含量计算E2/E6比值，并根据cut-off值判断HPV58的整合状态。　　 结果　　 1、单一HPV58型阳性的235个样本的基因变异存在多态性。HPV58型的E6(83.8％)，E7(76.7％)，L1(90.8％)基因及LCR(91.4％)都有很高的基因变异率。其中最常见的变异分别为E6基因的C307T(52.4％)，E7基因的T744G(74.9％)，L1基因的A6014C(56.9％)和LCR的C7266T(53.4％)变异。共有9个核苷酸变异发生于E6基因，其中A140G(T11A)，A184C(E25D)，G266C(V53L)和A313G都是新发现的变异。E7基因序列呈现4种典型的核苷酸改变，分别为G761A(G63D)，G694A(G41R)， T803C(V77A)和T744G。在L1基因中，共发现39个变异发生在34处核苷酸位点，有13个氨基酸发生了替换，大部分变异(21/39)以前都未曾报道。LCR中，共发现了29处变异，包括28处碱基替换和一处插入TGTCAGTTTCCT共12bp的变异，其中有8处为新发现的变异。最常见的发生在A7714C位的变异位于转录因子C/EBP结合位点上，且A7714C的变异显示其更易出现在宫颈上皮内瘤变的病例中(P=0.037)。我国东北地区妇女感染HPV58型的主要流行株属于A系，本研究中共有142株HPV58型病毒属于此系(142/174，81.6％)。　　 2、本研究中共收集102例HPV基因分型检测HPV58型感染样本。所有样本的HPV58病毒载量经过内参β-actin标准化后的数值（copies/基因组当量）进行比较，各组中位数分别为:正常及宫颈炎组412.99，LSILs组821.04，HSILs组1039.55及CC组657.04，除CC组外，其余各组病毒载量随宫颈病变的严重程度而增加，但各组间的病毒载量并无统计学差异。根据E2/E6的比值判断，本研究检测到的102株HPV58型病毒在体内感染状态以部分整合型为主，80株(78.4％)为部分整合型，20株(19.6％)为游离型，2株(2.0％)完全整合型。其中CC组与其它三组比较，E2/E6比值显著降低，P=0.001。　　 结论：　　 1、HPV58型A系是中国东北妇女中最主要的HPV58型流行株。研究中发现HPV58型基因具有很高的变异率，特别是位于E6，L1基因及LCR调控区的新核苷酸变异。同时，本研究发现在LCR调控区的A7714C变异与HPV58型感染妇女的宫颈病变程度相关，对于认识HPV58型的致病机制及本地区的预防和治疗具有重要意义。　　 2、本研究发现HPV58型病毒载量在癌前病变随着宫颈病变的严重程度而增加;同时发现HPV58型与其他高危型HPV感染相比，在感染早期即开始整合，即使对于宫颈炎症及LSILs情况的患者，病毒主要以部分整合感染为主。在宫颈癌患者中，其E2/E6比值明显低于其他宫颈病变病例，提示高程度的病毒整合可能为预示宫颈发生癌变的标志之一。