论文部分内容阅读
研究目的:肝细胞癌（HCC）是肝癌中最常见的组织学亚型,是与癌症相关而致死的三大因素之一[1,2]。针对早期的肝癌患者,手术切除、射频消融等疗法将是首选和最合理的医疗选择[3]。由于肝癌的强侵袭性和隐蔽性,大多数患者被诊断为中晚期[4]。然而,现有针对中晚期肝癌疗法仍有局限性,其对患者预后的改善不令人满意[5]。所以,通过发现早期诊断的生物标记和小分子靶点,可以为肝癌的诊断开拓新的渠道。孕激素和脂联受体（PAQR）家族是一个新的膜受体家族,由11个成员组成（PAQR1至PAQR11）[6]。许多研究人员已经证明PAQR蛋白影响新陈代谢和肿瘤发生[6-9]。例如,PAQR3在许多癌症中被确定为肿瘤抑制因子[10-14]。此外,研究已表明,PAQR4在各种实体肿瘤中的检测中高度表达,主要是非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌,并促进上述癌症的进展[15-21]。此外,有文献证明PAQR4的上调与几种癌症的不良预后有关[15-17]。然而,PAQR4在肝癌中的作用及其调控机制尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途径（PI3K/AKT）调节细胞的正常生理活动。另一方面,越来越多的证据证实PI3K/AKT通路的异常激活参与了恶性肿瘤的发生和发展[22-25]。该途径的去调控有助于癌细胞的增殖、侵袭、迁移和治疗抗性,并抑制细胞凋亡[26-28]。值得一提的是,PI3K/AKT通路在肝癌的发展中起了至关重要性影响。先前的研究表明,通过APLN的药理学靶向抑制PI3K/AKT信号可降低HCC中的细胞增殖并触发细胞凋亡[29]。Ma等人证明PI3K/AKT通路对于CD73在肝癌中发挥其致癌功能至关重要。血管内皮生长因子（VEGF）被认为是血管生成的有效因子。有研究表明,血管内皮生长因子及其受体（VEGFR）在肿瘤组织中可高表达,并参与肿瘤的进展和转移。阿帕替尼是靶向于VEGFR-2的口服小分子酪氨酸激酶抑制剂,它可以通过阻断VEGFR-2下游的多种信号转导途径抑制血管生成,进而控制肿瘤的发生和发展,并且可以使增敏性肿瘤细胞对化疗药物敏感,提高常规化疗药物的有效性。目前的研究显示,阿帕替尼能够延长临床肝癌肿瘤患者的中位总体生存期和无进展生存期,但其令人诟病的并发症和不确定的临床疗效仍有待研究,因此即便有可能成为肝癌二线及以上治疗的药物,如何降低计量并提高疗效仍旧成为当今临床研究的话题。本研究前期通过检索生物信息学数据库,发现PAQR4在肝细胞癌组织中的表达异常升高。然而目前尚无文献报道PAQR4在肝细胞癌发展中的作用,也不清楚PAQR4对肝癌细胞的作用。因此,本课题拟研究PAQR4对肝癌细胞的作用以及与阿帕替尼的联合作用,为治疗肝细胞癌寻找潜在的靶点。研究方法:1、采用免疫荧光定量检测PAQR4在肝细胞恶性肿瘤中的表达情况,并分析其与临床病理或预后的联系。2、用蛋白免疫印迹技术（Western blotting）测定目标蛋白质的表达,并利用流式细胞仪测定目标蛋白对肝癌细胞生长、周期和凋亡的影响。3、划痕实验检测肿瘤细胞的侵袭力。4、构建裸鼠异种移植瘤模型用于后续实验验证。5、采用RT-q PCR方法检测目的基因的m RNA水平表达。6、HE染色观察各组瘤组织病理变化情况。7、Western blot检测各组瘤组织中PAQR4、Ki-67、PARP、cleaved PARP、caspase3、cleaved caspase3、PI3K-p85、p-p85（Tyr467/199）、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白的表达。8、免疫组化检测异体肿瘤组织内蛋白表达情况。结果:GEPIA数据库分析表明,PAQR4在肝细胞癌样本中高表达,并且PAQR4的m RNA水平与肝细胞癌患者的总体生存率呈负相关,与病理侵袭性相关指标Ki67呈正相关。流式细胞检测技术分析表明,沉默Hep3B细胞中的目标蛋白表达水平后,可以通过抑制在细胞周期中的G1到S的转变而更有效的控制细胞的生长。沉默PAQR4表达同样也能够加速细胞凋亡。沉默PAQR4抑制了Hep3B细胞的迁移和侵袭潜能。沉默PAQR4使Hep3B细胞对阿帕替尼的化疗增加敏感性。沉默PAQR4阻断了PI3K/AKT通路的激活,AKT和p85的磷酸化得到了降低。相反,PAQR4的过度表达在Huh-7细胞中产生相反的作用。PI3K信号通路的抑制剂LY294002可消除PAQR4对细胞增殖、凋亡和侵袭的影响,说明PAQR4通过该通路发挥促进肿瘤生长的目的。在裸鼠移植瘤模型中,沉默PAQR4的表达可以抑制体内肿瘤生长,而PAQR4过度表达促进肿瘤生长,沉默PAQR4可以增加阿帕替尼的抗瘤作用。结论:肝癌组织内PAQR4表达与患者生存期存在相关性,阿帕替尼作为国产靶向药可以有效的抑制肝癌肿瘤的发展,PAQR4在肝癌的发展中起到促进肝癌发生的作用,并且通过PI3K/AKT信号通路发挥作用,抑制PAQR4可以使患者对阿帕替尼的敏感性进一步加强。