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第一部分LRG1在糖尿病患者血清及玻璃体中的表达研究目的:糖尿病视网膜病变的特征在于微血管的改变,且视网膜微血管的病变危害较大,往往是导致患者失明的直接原因。LRG1蛋白是富亮氨酸重复(leucine-rich repeat,LRR)蛋白家族高度保守的成员之一,与异常血管形成及细胞凋亡有关。本研究通过定量检测LRG1蛋白在正常人群、糖尿病患者、非增生性糖尿病视网膜病变患者(proliferative non-diabetic retinopathy,NPDR)、增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者血清及PDR患者玻璃体液中的表达变化,探索LRG1能否作为DR的血清生物标记物以监测DR的发生发展。方法:本研究纳入实验组和对照组患者共119人。其中,正常对照组22人,糖尿病患者(不伴有DR)22人,NPDR患者20人,PDR患者22人;待行玻璃体切除术PDR患者22人,黄斑前膜或黄斑裂孔待手术(排除糖尿病)患者11人。收集所有患者血清及后两组手术患者玻璃体样本,离心后-80℃超低温冰箱冻存,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组样本中LRG1蛋白的含量。所得数据均进行正态性检验,各指标采用均数加减标准差(?x±s)表示,使用两独立样本均数的t检验比较两样本均数的差异,使用卡方检验、单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验进行多组样本均数的比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:各组患者年龄、性别比较,差异均无统计学意义(P>0.05),实验分组具有可比性。PDR患者血清LRG1蛋白水平(9025±1994 pg/mL)与对照组(5975±2069 pg/mL)、无DR组(6550±2203 pg/mL)、NPDR组(6771±2120 pg/mL)比较均有统计学差异(P<0.0001、P<0.001、P<0.005)。其余组间差别无统计学差异。PDR组患者玻璃体中LRG1浓度为562.1±273.5 pg/mL,显著高于对照组玻璃体中LRG1浓度(130.0±102.8 pg/mL),差异具有统计学意义(P=0.000)。PDR组患者血和玻璃体中LRG1浓度的相关性分析,差异无统计学意义(r=0.1415,P=0.5196>0.05)。结论:PDR患者血和玻璃体中LRG1水平较对照组均显著升高,PDR组患者血和玻璃体中LRG1浓度无明显相关性。能否通过检测血LRG1水平快速筛查PDR仍需进一步研究。第二部分LRG1对高糖条件下周细胞凋亡的作用研究目的:研究LRG1蛋白在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠视网膜及高糖培养的牛原代视网膜微血管周细胞上的表达情况,检测LRG1蛋白水平改变对周细胞凋亡的影响并初步探索其作用机制,以期能为预防及治疗DR提供新的作用靶点。方法:建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型、分离培养原代牛视网膜微血管周细胞,采用Western blot方法检测对照组和STZ诱导的糖尿病大鼠8周时视网膜LRG1蛋白的表达水平,并进一步利用免疫组化检测对照组和STZ诱导的糖尿病大鼠8周时视网膜LRG1蛋白的表达免疫反应性。Western blot方法、荧光定量PCR法、免疫细胞化学法检测高糖条件下牛视网膜微血管周细胞LRG1蛋白质水平、mRNA水平、细胞免疫染色。通过转染siRNA的方法细胞水平建立LRG1敲除模型,运用MTS、TUNEL和流式细胞仪检测高糖诱导的视网膜微血管周细胞凋亡水平。Western blot方法及MTS法观察LRG1蛋白水平的改变对高糖培养的周细胞BCL-2蛋白家族含量、PI3K/Akt通路表达、MAPK通路表达的影响。结果:1.糖尿病大鼠模型建立成功,与对照组相比,LRG1蛋白在视网膜血管上表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),且LRG1局限表达在血管上。2.LRG1蛋白及mRNA在30mmol/L高糖条件下在牛视网膜微血管周细胞上高表达(P<0.001)。且LRG1主要表达在细胞胞浆。3.通过转染LRG1siRNA可靶向抑制LRG1的表达,在正常糖浓度作用下对细胞活力无明显影响(P>0.05),与之不同的是在高糖条件下,沉默LRG1的表达可显著减少周细胞的凋亡(P<0.005)。4.在高糖条件下上调PDGF通路可显著减少周细胞的凋亡(P<0.05)。5.在高糖作用下,周细胞凋亡,凋亡相关因子Bax、Bcl-2、p-Akt、p-P38、p-JNK的水平发生改变,抑制LRG1可以减少相应的改变。6.在高糖条件下,抑制PI3K/Akt通路可以削弱干预LRG1对周细胞的保护作用(P<0.05)。结论:1.LRG1蛋白在SD大鼠视网膜血管上及周细胞内均有表达,高糖作用下,其表达显著增高;2.PDGF的上调可减少高糖诱导的周细胞凋亡;3.高糖条件下,下调LRG1的表达可减少周细胞的凋亡;4.PI3K/Akt通路、P38 MAPK通路可能参与这一调控。