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肉鸡腿病问题是现代化、规模化养殖模式中一直存在的问题,给养殖户带来巨大的经济损失和动物福利困扰。导致肉鸡腿病发生的病因多且复杂,遗传选育已经被证明可以降低腿病的发生率。肉鸡肢体内外翻畸形（Valgus-varus deformity,VVD）是肉鸡中常见的以胫跗骨和跗跖骨发生超过20°反转为特征的长骨病。为筛选揭示VVD的遗传机制和发病机制的重要调控因子,本研究以VVD肉鸡和健康肉鸡的脾脏为材料,利用转录组测序技术,筛选差异miRNA,并对筛选到的miR-15a进行功能验证。首先探究了miR-15a在各组织中的表达情况;之后在HD11细胞和软骨细胞中过表达/干扰miR-15a,探究miR-15a的功能作用,并通过软件和试验筛选验证miR-15a的靶基因。以上研究为研究肉鸡VVD发病机制提供参考和依据。主要结果如下:研究一:肉鸡腿病转录组测序及差异miRNA筛选1、以3只健康肉鸡和3只VVD肉鸡的脾脏为材料,成功构建6个c DNA文库并进行了miRNA测序。2、对测序结果进行分析,根据|log2 FC|≥1和q＜0.05为筛选标准,共筛选到50个差异miRNA,其中30个上调,20个下调。3、通过对差异miRNA预测的靶基因进行功能注释,发现其富集在MAPK、JAK-STAT等与免疫和骨骼发育相关信号通路上。4、通过构建m RNA-miRNA网络互作网络分析,发现由一个由7个差异miRNAs和14个差异m RNAs互相调控的关系网络。研究二:通过HD11细胞研究gga-miR-15a对炎症反应的影响1、组织表达谱分析显示,miR-15a在心脏、脾脏、肝脏、腿肌、胸肌、胰腺、胸腺、法氏囊、软骨组织中都有表达。与健康组肉鸡相比,miR-15a在VVD肉鸡的心脏、胸肌组织中显著低表达（P＜0.01）,在肝脏（P＜0.01）、脾脏（P＜0.05）、胸腺（P＜0.01）中显著高表达。2、HD11细胞过表达/干扰miR-15a检测炎性因子的表达情况。结果显示,与NC组相比,过表达组的促炎因子IL-1β（P＜0.01）、IL-6（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.05）、NLRP3（P＜0.05）表达量显著下降。与NC组相比,干扰组的促炎因子TNF-α（P＜0.01）、INF-γ（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）表达量显著上升,抗炎因子TGF-β3（P＜0.01）表达水平显著降低。由此可看出,miR-15a有抑制炎症反应的作用。3、HD11细胞过表达/干扰miR-15a检测凋亡基因。结果显示,与NC组相比,过表达miR-15a显著下调BCL-2（P＜0.01）、Bax（P＜0.01）、Fas（P＜0.01）;干扰miR-15a后Fas L（P＜0.01）表达情况显著升高。结果提示,miR-15a促进细胞凋亡。miR-15a对细胞增殖的影响,CCK8和EDU结果显示,过表达miR-15a抑制细胞增殖速度和数量,干扰miR-15a促进细胞增殖速度和数量。结果提示,miR-15a抑制细胞增殖。研究三:gga-miR-15a靶基因筛选与验证本研究通过软件结合前期转录组数据结果,初步筛选到RPS6KA3、CASK、FKBP5等8个差异基因作为miR-15a的候选靶基因进行靶向验证。结合荧光定量PCR初步验证结果,以及GO和KEGG分析最终筛选FKBP5、CASK为miR-15a候选靶基因,构建含有结合位点的野生型和突变型载体,并通过双荧光素酶基因检测报告发现CASK与miR-15a有靶向关系。研究四:体外分离培养软骨细胞及gga-miR-15a对软骨细胞的影响1、使用联合酶法成功分离并培养了状态、生理良好的鸡关节软骨细胞。2、软骨细胞过表达/干扰miR-15a后检测相关基因的变化。与NC组相比,过表达miR-15a显著下调了软骨细胞标志基因蛋白聚糖（P＜0.01）;成熟分化基因Runx2（P＜0.01）、SOX9（P＜0.01）显著降低;凋亡基因Fas（P＜0.01）显著上升,BCL-2（P＜0.01）、Fas L（P＜0.01）表达量显著下降。干扰miR-15a后,与NC组相比,干扰组的collgen-10表达量显著下降（P＜0.05）,成熟分化基因Runx2（P＜0.05）表达量显著升高,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8显著下降（P＜0.01）,凋亡基因Fas（P＜0.01）显著下降。结果说明miR-15a抑制软骨细胞分泌胶原的能力,影响软骨基质形成,抑制软骨细胞成熟分化,促进细胞凋亡。3、CCK8和EDU结果显示,过表达miR-15a抑制软骨细胞增殖,而干扰miR-15a则促进软骨细胞增殖。