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研究目的: 结核病(TB)是一种长期危害人类健康的传染病。为了解决临床上抗结核药物耐药性日趋严重和结核病低治愈率等难题,寻找具有新型药物作用靶点的抗结核药物就显得尤为重要。近年来细胞自噬在重大传染性疾病的研究中逐渐成为热点。许多证据表明细胞自噬在清除胞内结核菌的过程中起着非常重要的作用,细胞自噬已逐渐成为治疗结核病的新型靶标。本课题组经前期研究发现四种中药单体黄芩苷、淫羊藿苷、大蓟苷和杨梅素,具有潜在诱导结核菌感染巨噬细胞自噬的作用。为此本研究将明确这四种中药单体诱导结核菌感染巨噬细胞模型的自噬作用和对胞内结核菌的清除效果,并对其可能作用机制进行研究。同时,为增强以上四种单体诱导小鼠巨噬细胞模型细胞自噬的效果,本研究选用维生素D(主要成分为1α,25(OH)2D3)与四种中药单体联用,并观察联用后诱导结核菌感染巨噬细胞模型的自噬作用和清除胞内结核菌效果是否增强,进而探讨药物联用后的可能作用机制。为发现新型诱导自噬清除结核菌的药物奠定基础。 研究方法和实验结果: (1)建立结核菌感染小鼠巨噬细胞Raw264.7模型,利用吖啶橙(AcridineOrange,AO)和溶酶体示踪剂(Lyso-TrackerTM Red)染色技术,从形态学角度观察感染模型的自噬水平。利用Western-blot法对自噬相关蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ和p62进行检测,根据自噬标志性蛋白的表达水平明确中药单体诱导结核菌感染巨噬细胞模型的自噬作用。实验结果发现与模型组相比,中药单体组及中药单体联合维生素D组酸性囊泡产生的数量高于模型组、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达高于模型组、p62表达低于模型组。 (2)借助细菌菌落计数法(CFU)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR)技术对细胞内结核菌的存活率和结核菌Ag85B基因进行检测,评价药物诱导自噬对胞内结核菌存活率的影响。实验结果发现与模型组相比,中药单体组可以不同程度抑制结核菌的胞内存活率和结核菌特异性基因Ag85B的表达;中药单体联合维生素D组结核菌特异性基因Ag85B的表达低于单体组和模型组。 (3)使用Western-blot法对自噬相关信号通路Ⅰ型PI3K/Akt/mTOR、AMPK、MAPK(p38)的磷酸化水平进行检测,探索中药单体组和中药单体联合维生素D组诱导自噬的具体作用机制。结果发现与模型组相比,黄芩苷组和大蓟苷组的Akt和mTOR的磷酸化水平低于模型组;淫羊藿苷组mTOR的磷酸化水平低于模型组;杨梅素组Akt磷酸化水平低于模型组,p38磷酸化水平高于模型组。与模型组相比,四种中药单体联合维生素D组AMPK磷酸化水平均高于模型组。 结论: 1.四种中药单体黄芩苷、大蓟苷、淫羊藿苷、杨梅素可以不同程度的诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7自噬水平升高,并抑制胞内结核菌的存活率。 2.四种中药单体黄芩苷、大蓟苷、淫羊藿苷、杨梅素诱导结核菌感染小鼠巨噬细胞Raw264.7自噬的机制各不相同:黄芩苷和大蓟苷通过抑制Akt和mTOR的磷酸化水平诱导自噬;淫羊藿苷通过抑制mTOR的磷酸化水平诱导自噬;杨梅素则通过抑制Akt和增强p38的磷酸化水平诱导自噬。 3.维生素D辅助黄芩苷、大蓟苷、淫羊藿苷、杨梅素诱导结核菌感染巨噬细胞自噬增强的机制是通过激活AMPK通路实现的。