猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染导致生长猪、肥育猪和母猪的呼吸道疾病和繁殖失败,给养猪业带来巨大的经济损失。PRRSV编码的大的非结构蛋白nsp2是各个毒株基因组之间变异最快的蛋白,其氨基端PL2核心结构域在动脉炎病毒属成员中高度保守。PL2蛋白酶可以通过其去泛素化酶活性抑制干扰素信号通路,影响机体的天然免疫对病毒的应答。此外PL2可能还具有顺反式酶切活性,在介导nsp2/3切割的过程中发挥作用,可以调控病毒的转录和复制,并研究其具有三联催化活性位点(Cys55-Asp91-His124)以及一些对酶活性有重要作用的氨基酸(Cys110,Cys142和Cys147)。PL2的3D结构的解析可为nsp2复杂功能的认识提供细微的结构依据,本研究选择非结构蛋白nsp2的PL2结构域及与其修饰密切相关的泛素分子,通过对构建的不同融合表达蛋白纯化及晶体结构解析,以期为揭示其在病毒复制和致病的机制。主要研究结果如下:(1)不同Nsp2 PL2泛素链接蛋白表达特性及晶体制备:为了解PL2蛋白酶发挥DUB活性及对细胞泛素化过程,我们构建了Strep标签纯化的、包含PL2及Ub分子链接的原核表达质粒,了解了不同蛋白的表达,纯化特征。首先大肠杆菌表达获取了PL2蛋白,经Strep亲和层析、离子交换和凝胶过滤层析纯化PL2蛋白,至其纯度为95%以上,在蛋白浓度为5 mg/mL左右的条件下对蛋白结晶条件进行初筛。研究了不同纯化流程、还原剂、结晶池液等对结晶形成的影响,通过结晶条件优化,应用油滴法16℃结晶24-36 h,观察到PL2蛋白在20%PEG 3350、0.2 M甲酸镁和30%PEG 400、0.1 M二甲砷酸钠PH6.5、0.2 M硫酸锂的结晶缓冲液中长出菱形晶体和短小针状、数量较多、分布杂乱的微晶。菱形晶体及微晶均未检测到规律的衍射图,进一步优化晶体条件,最终优化出短粗和长细两种晶形的蛋白晶体,但是衍射率极低,未获得有效的晶体解析数据。对蛋白性质研究的结果表明,PRRSV PL2蛋白聚集状态具有浓度依赖性,蛋白浓度的升高,多聚体显著增多。蛋白内部半胱氨酸含量高达15%,推测二硫键错配可能造成蛋白不均一性,造成蛋白晶体的多态性。(2)PL2蛋白去泛素化特性检测:为了解PL2去泛素化酶活性及特征,选择可进行Lys48、Lys63或线性泛素化的泛素化蛋白RIG-I、Nsp1α、NEMO与不同泛素化分子作用后,加入原核表达纯化的PL2蛋白,体外研究其去泛素化特性。构建PL2真核表达载体,和多种特异位点泛素共转染,检测PL2去泛素化作用模式。结果表明PL2蛋白可以进行K48、K63位泛素化蛋白的去泛素化修饰;对线性泛素化也有切割活性。综上,纯化PL2蛋白表现出多聚特性,高二硫键影响规则晶体及衍射图的形成;重组PL2蛋白具有去泛素化酶活性,可以对K48、K63、线性泛素化蛋白有去泛素化作用。对PRRSV的PL2去泛素化酶的生化特性和结构特征的研究,有助于加深我们对PRRSV病原分子机制的认识。