论文部分内容阅读
目的通过研究重型再生障碍性贫血(Severe Aplastic Anemia, SAA)患者外周血CD3+T淋巴细胞中T细胞活化衔接因子(Linker for activation of T cells, LAT)表达水平、LAT的表达与SAA患者CD8+T细胞功能的关系以及LAT在T细胞中的作用机制,证实LAT与SAA患者T细胞过度增殖及功能亢进之间的因果效应,进一步阐明SAA免疫损伤骨髓造血的机制,为开发SAA靶向治疗提供理论依据。方法研究对象为天津医科大学总医院2012年9月至2013年9月初治SAA患者14例、治疗后缓解的SAA患者12例及正常对照者12例。第一部分研究SAA患者外周血T细胞中LAT的表达水平及其与CD8+T细胞功能的关系,采用流式细胞术检测14例初治SAA患者、12例治疗后缓解的患者及12例正常对照者外周血T细胞LAT及其相关信号分子ZAP-70及pLAT的表达,以及外周血CD8+T细胞中LAT的表达水平及穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)的表达。采用免疫磁珠分选以上病例外周血CD3+T细胞,实时定量PCR检测分选细胞LAT mRNA的表达水平。将以上病例外周血T细胞中LAT的表达水平和T细胞比例做了相关分析,以及将外周血CD8+T细胞中LAT的表达分别和CD8+T细胞上穿孔素和颗粒酶B的表达做相关性分析。第二部分研究LAT在T细胞中的作用机制。以免疫磁珠分选10例初治SAA患者外周血CD3+T细胞,分为两组,分别转染LAT-siRNA和阴性对照,孵育48h后流式细胞术检测CD8+T细胞穿孔素和颗粒酶B的表达水平,用ELISA法检测培养液IL-4和IFN-γ的浓度水平。免疫磁珠分选7例健康人外周血CD3+T细胞,分为两组,分别转染pCMV-myc-LAT和pCMV-myc质粒,孵育48h后,再分别加入K562细胞共培养48h,流式细胞术检测CD8+T细胞穿孔素和颗粒酶B的表达水平以及K562细胞的凋亡状况,并用ELISA检测培养液中IL-4和IFN-γ的浓度水平。结果第一部分SAA初治组CD3+T细胞中LAT、ZAP-70和pLAT的中位表达量分别为49.55(26.97-91.34)%,33(17.31-85.41)%和8.31(3.3-13.39)%,正常对照组CD3+T细胞中LAT、ZAP-70和pLAT的表达量分别为14.81(1.76-29.64)%,4.06(1.16-9.93)%和0.27(0-0.82)%,前者明显高于后者(P<0.01)。SAA初治组CD3+T细胞中LAT mRNA的相对表达量为5.484(3.418-7.905),正常对照组CD3+T细胞中LAT mRNA的表达量为1.305(0.462-2.545),前者明显高于后者(P<0.01)。经过免疫抑制治疗后,SAA缓解组CD3+T细胞中LAT、ZAP-70、 pLAT及LAT mRNA的表达量分别为30.25(24.25-58.24)%,19.23(6.33-54.45)%,2.29(0.46-7.99)%和3.897(0.538.7.934),明显低于SAA初治组(P<0.01)。T细胞中LAT的表达量和T细胞比例呈正相关(r=0.1831,P<0.05)。外周血CD8+T细胞中穿孔素的表达量和CD8+T细胞中LAT的表达量呈正相关(r=0.6503,P<0.05),外周血CD8+T细胞中颗粒酶B的表达量和CD8+T细胞中LAT的表达量也呈正相关(r=0.1936,P<0.05)。第二部分1.LAT敲低组中CD3+T细胞中LAT、CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的中位表达量分别为32.52(19.63-45.55)%,2.015(0.39-13.02)%和18.99(1.27-42.78)%,阴性对照组中CD3+T细胞中LAT、CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达量分别为59.14(38.15-82.08)%,6.73(1.82-25.09)%和40.215(6.36-66.25)%,前者明显低于后者(P<0.05)。ELISA测LAT敲低组上清中IFN-γ的中位浓度为15.633(11.394-18.975)pg/ml,明显低于阴性对照组,IL-4的中位浓度为12.196(8.336-14.966)pg/ml,和阴性对照组相比没有统计学意义(P>0.05)。2. LAT过表达组中CD3+T细胞中LAT, CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的中位表达量以及K562细胞的中位凋亡率分别为35.79(24.1-39.34)%、7.89(4.85-15.08)%、18.3(16.94-23.36)%和25(9.6-38.46)%,阴性对照组中CD3+T细胞中LAT, CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达量以及K562细胞的凋亡率分别为15.39(7.35-18.7)%、3.3(1.96-6.91)%、11.41(8.25-14.66)%和12.33(2.5-14.84)%,前者明显高于后者(P<0.05)。ELISA测LAT过表达组上清中IFN-γ的浓度为22.374(19.355-24.814)pg/ml,明显高于阴性对照组,IL-4的浓度为18.834(12.187-18.942)pg/ml,和阴性对照组相比没有统计学意义(P>0.05)。结论1、SAA患者外周血T细胞中适配蛋白LAT的表达明显高于正常人,并且免疫抑制治疗可以显著降低LAT的表达。2、SAA患者外周血CD8+T细胞功能和LAT的表达呈正相关,LAT的低表达可降低CTL细胞的功能,LAT过表达则可造成CTL细胞的功能亢进,并增强其破坏造血干细胞的作用。3、LAT过表达可促进IFN-γ的分泌并抑制IL-4的分泌。