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研究目的:1.明确同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)在小鼠成纤维细胞凋亡过程中的作用及可能作用机制;2.明确外源调控HIPK2对JNK凋亡信号通路的影响,并初步探讨二者之间的可能调控机制。3.探究HIPK2过表达对博来霉素(Bleomycin,BLM)诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化及JNK通路的影响。研究方法:购买含绿色荧光蛋白(Green Flurescence Protein,GFP)示踪基因的HIPK2腺病毒载体(Ad-HIPK2)和靶向HIPK2的特异性shRNA腺病毒载体(Ad-sh-HIPK2)。体外培养小鼠肺成纤维细胞(MLF),并分为7组:(1)单纯腺病毒载体感染组:Ad-GFP组、Ad-HIPK2组、Ad-sh-control组和Ad-sh-HIPK2组;(2)加入JNK抑制剂SP60025后分组为Ad-GFP组、Ad-HIPK2组和Ad-HIPK2+SP600125组。随后用CCK8、流式细胞式及Transwell法检测增殖、凋亡及侵袭能力,RT-PCR检测各组细胞HIPK2、JNK、Daxx、Bax、Bc1-2、caspase3、CollaⅠ/Ⅲ、及α-SMA等mRNA的表达,Western blot检测各组细胞HIPK2、JNK、Daxx、Bax、Bc1-2、caspase3、CollaⅠ/Ⅲ及α-SMA等蛋白的表达情况。随机将小鼠分为3组:Mock组、Ad-control-GFP组、Ad-HIPK2组,构建小鼠肺纤维化模型,分别在第7天、第14天和第28天处死小鼠,取外周血及肺组织备用。各组小鼠肺组织用苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色处理后显微镜下观察肺组织纤维化程度,并根据Ashcroft提出的肺纤维化分级法进行纤维化程度分级和计算其积分。各组小鼠肺组织进行免疫组化后用显微镜观察病理改变。对各组小鼠肺组织进行Western blot检测HIPK2、JNK、Daxx、Bax、Bc1-2、caspase3、CollaⅠ/Ⅲ及α-SMA等蛋白的表达情况。对各组小鼠肺组织进行RT-PCR检测HIPK2、JNK、Daxx、Bax、Bc1-2、caspase3、CollaⅠ/Ⅲ、及α-SMA等mRNA的表达。研究结果CollaⅠ/Ⅲ、Bcl-2表达降低(t=13.807,26.961,33.033,80.682,P<0.05);与Ad-sh-control组相比,Ad-sh-HIPK2组的HIPK2、JNK、Daxx、Bax和caspase3的表达降低(t=27.092,81.004,44.752,22.381,9.164,P<0.05),α-SMA,CollaⅠ/Ⅲ、Bcl-2表达增高(t=-49.693,-11.699,-51.133,-22.107,P<0.05)(2)加入JNK抑制剂SP60025后,与Ad-HIPK2组相比,Ad-HIPK2+sp600125组α-SMA,CollaⅠ/Ⅲ,Bcl-2的表达降低被逆转(t=-8.935,-25.368,-42.521,-41.955,P<0.05),JNK、Daxx、Bax和caspase 3的表达升高被逆转(t=38.243,36.927,25.003,26.964,P<0.05)(3)第7、14和28天在小鼠肺组织中,与Ad-control组相比,Ad-HIKP2组的HIPK2、JNK、Daxx、Bax和caspase 3的表达明显增高(F=207.399,164.085,52.908,28.319,409.572,27.594,110.366,81.654,51.857,147.352,868.200,584.09,592.618,101.180,102.021,P<0.05),Bcl-2、CollaⅠ/Ⅲ、α-SMA表达降低(F=231.765,634.970,665.99,50.553,203.060,126.400,758.839,499.804,997.980,63.884,7.516,111.564,P<0.05)2.q PCR检测结果显示:(1)与Ad-GFP组相比,Ad-HIPK2组的HIPK2、JNK、Daxx、Bax和caspase 3的m RNA表达增高(t=-25.682,-102.237,-75.136,-37.712,-58.409,P<0.05),α-SMA,CollaⅠ/Ⅲ、Bcl-2的m RNA表达降低(t=88.236,120.736,82.103,82.918,P<0.05);Ad-sh-control组相比,Ad-sh-HIPK2组的HIPK2、JNK、Daxx、Bax和caspase 3的m RNA表达降低(t=107.293,55.432,81.967,81.412,134.987,P<0.05),α-SMA,2CollaⅠ/Ⅲ、Bcl-2的m RNA表达增高(t=-47.065,-30.113,-47.609,-65.331,P<0.05)(2)加入JNK抑制剂SP60025后,与Ad-HIPK2组相比,Ad-HIPK2+sp600125组α-SMA,CollaⅠ/Ⅲ,Bcl-2的m RNA表达降低被逆转(t=2.876,-21.515,-22.850,-10.138,P<0.05),HIPK2、JNK、Daxx、Bax和caspase 3的m RNA表达升高被逆转(t=18.840,40.464,17.536,18.925,27.360,P<0.05)(3)第7、14和28天在小鼠肺组织中,与Ad-control组相比,Ad-HIKP2组中的HIPK2、JNK、Daxx、Bax和caspase 3的m RNA表达明显增高(F=498.286,7726.904,20487.425,947.675,961.972,1179.546,289.350,368.329,486.140,581.471,303.795,594.657,323.379,356.309,403.481,P<0.05),Bcl-2、CollaⅠ/Ⅲ、α-SMA的m RNA表达降低(F=400.861,219.497,985.603,176.682,394.411,1971.132,459.149,952.629,3063.192,201.780,257.067,254.260,P<0.05)3.Transwell、CCK-8及流式细胞术检测结果显示:(1)与Ad-GFP组相比,Ad-HIPK2组穿过小室的细胞数减少(t=12.369,P<0.05),24h、48h、72h增殖减少(t=10.988,17.163,22.269,P<0.05),MLF凋亡率增加(t=-89.628,P<0.05)。与Ad-sh-control组相比,Ad-sh-HIPK2穿过小室的细胞数增多(t=23.401,P<0.05),24h、48h、72h增殖增加(t=-6.245,-33.459,-37.844,P<0.05),MLF凋亡率降低(t=17.835,P<0.05)。(2)加入JNK抑制剂SP60025后,与Ad-GFP组相比,Ad-HIPK2组穿过小室的细胞数减少(t=10.335,P<0.05),24h、48h、72h增殖减少(t=15.563,13.025,45.481,P<0.05),MLF凋亡率增加(t=-24.165,P<0.05);与Ad-HIPK2组相比,Ad-HIPK2-sp600125组穿过小室的细胞数增多(t=-5.326,P<0.05),24h、48h、72h增殖增加(t=-15.052,-8.030,-30.905,P<0.05),MLF凋亡率降低(t=5.147,P<0.05)。4.对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型HE、Masson染色及纤维化评分,Ashcroft评分结果显示第7、14、28天与Mock组相比,Ad-control-GFP组纤维化评分升高(t=-7.604,-62.000,-176.317,P<0.05)。第7、14、28天时,与Ad-control-GFP组相比,Ad-HIPK2组纤维化评分降低(t=3.170,12.004,40.880,P<0.05)。5.免疫组化结果显示HIPK2蛋白阳性产物在Ad-HIPK2组肺组织中表达明显升高。研究结论:1.HIPK2过表达可能抑制MLF的增殖并促进其凋亡,减少胶原沉积和细胞外基质(ECM)的表达,减轻肺纤维化。HIPK2表达下调时结果相反。2.HIPK2过表达可能促进博来霉素小鼠成纤维细胞的凋亡,进而减轻小鼠肺纤维化。3.HIPK2可能通过影响JNK信号通路导致成纤维细胞增殖/凋亡失衡,减轻肺纤维化。